[发明专利]虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物及其设计和扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种高效扩增多种虾虎鱼类线粒体NADH还原酶复合体亚基1（NADH dehydrogenase subunits 1；ND1）基因全序列扩增引物及其设计和扩增方法。

背景技术

鱼类线粒体基因组由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因（12S rRNA及16S rRNA）共37个编码基因及一段主要的非编码区（控制区）组成，具有结构简单、拷贝数多、严格的母系遗传、几乎不发生重组、编码效率高、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点。由于鱼类线粒体基因组所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。

虾虎鱼类隶属于鲈形目、虾虎鱼亚目，是世界上种类最多，分布最广的鱼类类群之一。全世界的虾虎鱼种类估计有2000多种，它们形成一个庞大的生物类群，在水环境尤其是海洋生态环境中占有重要的地位。虾虎鱼多为肉食性的小型鱼类，遍布全世界，尤以热带为多，主要为海水鱼，大部分营底栖生活，主要特征是其腹鳍愈合成一吸盘状。近年来，由于过度捕捞、气候环境变化等原因，许多传统的经济鱼种资源已经形不成渔讯，有些甚至枯竭，但虾虎鱼类因其适应能力强、生命周期短、繁殖力强等原因，资源量却逐年增加。由于虾虎鱼类经济价值不高，国内外有关于虾虎鱼类的研究相对较少，因其种类繁多，外部形态特征极为相似，导致不易鉴别和认定。目前，虾虎鱼类的分类还不甚清晰，很多种类的分类地位还比较混乱。

线粒体全基因组及线粒体基因组上的相关基因作为分子标记已被广泛地用于鱼类的群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域。ND1作为脊椎动物线粒体蛋白质编码基因中7个编码NADH还原酶复合体亚基的基因之一，其进化上较为保守，可应用于动物的系统进化和分类研究。然而未曾有报道过扩增线粒体ND1基因全序列的通用引物，尤其是针对物种分布广泛、种类众多的虾虎鱼类。因此设计特异性扩增虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列的通用引物，从而为高效获得虾虎鱼线粒体ND1基因全序列及线粒体基因组全序列奠定基础。

发明内容

针对上述现有技术存在的空缺，本发明旨在提供一对可高效特异扩增多种虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列的核苷酸引物，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列以进行系统进化和分类研究提供一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物的设计方法，以及利用所述的虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物对虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列进行扩增的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明的轻链引物Gobies-ND1-F（SEQ ID No.1所示）有19个碱基：CGGAGAAATCCAGGTCAGT，位于16S rRNA基因上；重链引物Gobies-ND1-R （SEQ ID No.2所示）有19个碱基：CCAACATGTTTGGGGTATG，位于tRNA-Met基因上。

本发明所述的虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物对在东海海域采集的15种虾虎鱼类，均能获得片段长度为1300 bp左右的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含线粒体ND1基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-Ile基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及长度为115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取虾虎鱼类线粒ND1基因全序列以进行系统进化及分类研究提供一个有力工具。

作为优选，根据本发明所述的虾虎鱼类线粒体ND1基因全序列扩增引物，其中所述的虾虎鱼类包括但不限于下述：中华乌塘鳢、青弹涂鱼、斑纹舌虾虎鱼、髭缟虾虎鱼、孔虾虎鱼、绿斑细棘虾虎鱼、红狼牙虾虎鱼、普氏细棘虾虎鱼、斑尾刺虾虎鱼、大弹涂鱼、舟山缰虾虎鱼、平头竿虾虎鱼、矛尾刺虾虎鱼、双带缟虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼。