[发明专利]一种表皮细胞抑裂素及其制备方法和应用

说明书

技术领域

    本发明属于生化分离纯化技术领域，具体涉及一种表皮细胞抑裂素及其制备方法和应用. 

背景技术

表皮细胞抑裂素(简称皮抑素)是动物的表皮细胞产生的一种内源性的蛋白质细胞因子，它可以作用于动物的表皮细胞，抑制表皮细胞的有丝分裂使之停留在细胞生长周期的G1期。20世纪初就有人发现生物体内存在抑制细胞分裂的物质，以后有人发现一种组织的抽提液加到同种组织中能抑制该组织细胞的分裂。1960年Bulough和Laurence在研究体内上皮细胞分裂的控制中指出有一个内源性的细胞专一的抑制剂可以阻断细胞的生长周期，这种抑制剂是由细胞产生的一种内源性物质，在体内起负调控作用，因此提出“Chalone”这一名词命名这一类物质，指它们在体内起减速或中断的作用。Chalone由于来源不同，靶细胞不同而有许多种，例如淋巴细胞抑裂素、表皮细胞抑裂素、粒细胞抑裂素、肝细胞抑裂素等。它们都有4方面的共性：（1）有组织特异性（2）无种族特异性（3）无细胞毒性（4）可逆性。鉴于上述特异性，抑素对于一些异常的分裂、增殖应该可以起到抑制作用。显然具有潜在的应用前景，例如淋巴细胞抑裂素有可能发展为抗排异药、肝细胞抑裂素有抑制肝癌细胞快速生长的功能、表皮细胞抑裂素具有抑制某些类型银屑病病人皮屑大量生成的作用。 

发明内容： 

    本发明需要解决的问题是对皮抑素的提取纯化，作较大改进使之更适合工业化生产，使工艺更合理、得率更高、质量更好、更稳定。活性使用HaCat人永生化表皮细胞株中位测定法，使操作更方便、科学、可靠性、可比性更强

    本发明的技术方案    

    本发明所述表皮细胞抑裂素由动物皮分离纯化,分子量为30000-50000。

 ( 1)、表皮细胞抑裂素的制备方法: 取 新鲜猪皮削除所附脂肪组织，洗净，用绞肉机绞成肉皮糜，称量重量，加入三倍水用胶体磨将肉皮糜磨成匀浆，搅拌3小时、过滤，滤渣再加入二倍体积水再搅拌2小时，合并二次滤液。滤液脱脂肪，通过截止分子量10000的超滤膜过滤，浓缩至起始体积的3%-5%，将浓缩后超滤保留液用乙醇沉淀，取30%—80%的沉淀部分用PH7.5的磷酸缓冲液溶解，离心取上清。将上清液调至PH酸性此时皮抑素带正电荷，可以交换至SP—Sepharose离子交换柱上，而大量杂蛋白可以穿过而被洗去，改用PH8.0的磷酸缓冲液洗脱可得洗脱峰1，再改用含0.5 M NaCl 的PH8.0磷酸缓冲液洗脱可得洗脱峰2（层析结果见图1），测活性证明活性主要在峰1中，峰2中亦有部分活性SP—Sepharose F.F 是一种阳离子交换剂，皮抑素在酸性条件下带正电荷，可以交换在层析柱上，所有带负电荷的蛋白质不能交换在柱上，都在穿过峰中，被PH6.5的磷酸缓冲液洗脱；然后改用PH8.0的磷酸缓冲液，因为PH8.0高于皮抑素的等电点，皮抑素带负电荷，因此将大部分皮抑素洗下，再用含0.5M NaCl 的磷酸缓冲液，由于离子强度增加，其他等电点高的蛋白也被洗脱。活性测定结果：上柱前样品的比活性为2975u/mg，穿过峰面积很大但比活性很低，只有989u/mg，洗脱峰1面积很小但比活性很高，达到244285u/mg比上柱前提高82倍。洗脱峰2面积较小仍有少部分皮抑素，比活性为62160u/mg。 

    (2)、皮抑素的活性测定：采用HaCat人永生化表皮细胞株（购自上海复祥生物技术有限公司）细胞培养在RPMI1640培养液（含小牛血清10%）中，在37℃、CO2培养箱中培养，待细胞长至铺满培养瓶壁的80%左右时用0.25%胰蛋白酶将细胞消化，制成3×10⁴/ml。细胞悬液在96孔培养板中每孔加160μl细胞悬液，培养20小时后加入皮抑素40μl。稀释依溶液中皮抑素的含量而定，可以从每孔微克水平倍比稀释至纳克或者匹克水平，对照组加40μl培养液。各种浓度做三孔重复，继续培养72小时后加入5mg/ml MTT 20μl，再培养4小时，倒去上清加入二甲亚砜100μl显色，在酶标仪OD492nm处读数，将三个重复孔的读数取平均值，与对照组的平均值计算抑制百分率，规定抑制1%为一个活性微单位（mu）。将抑制百分率对每孔的蛋白质浓度做图，可得一个S型曲线，得上下平台，取上下平台的中值为活性点。活性点的蛋白量/孔含有的活性单位称为比活性（u/mg)，比活性代表皮抑素的纯度，比活性高表示皮抑素的活性亦高。 

 比活性（u/mg）=