[发明专利]一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检验和生物技术领域，具体地说，涉及一种检测肉及肉制品中牛源性成分的方法。

背景技术

食品掺杂使假一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法企业和商家为了降低成本，在肉制品加工过程中以猪肉冒充牛羊肉，或以其它低价肉替代高价肉而未在标签上注明。这不仅严重侵害了消费者利益，而且如果清真食品中掺有猪肉成分还会涉及到民族和宗教等问题，造成恶劣的社会影响。此外，流行病学研究证明饲料中的动物源性成分是造成“疯牛病”等神经系统疾病传播的主要因素。

目前，用于肉种成分鉴定的技术大多建立在对蛋白质结构与DNA序列特异性分析的基本上，包括酶联免疫(ELISA)、聚合酶链式反应（PCR)、电泳、色谱、生物传感分析等技术。其中，Taqman实时荧光PCR（Taqman PCR）法在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，成为该领域的主流技术，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。

然而，现有的研究大多集中在对饲料中猪、牛、羊等动物源性成分的定性检测上，而用于食品掺假鉴别，特别是涉及有关核酸成分定量检测技术的研究较为滞后。单纯的定性检测已不能满足需求，如在肉、奶等食品“掺杂使假”案件的处理中，如何判定掺假成分是添加还是污染所致，如何确定掺假严重程度都需要有可靠的定量技术作为依托。生物样品的复杂性，如动物种别、年龄、性别、器官、肌肉类型差别等，导致DNA提取总量和扩增靶序列模板总量差异，给标准样品的选定和制备造成困难。因此急需系统误差小、可信度高的食品掺假行为判定方法的出现。

发明内容

本发明目的是提供一种牛特异性引物和探针，用于检测肉及肉制品中牛源性成分。

本发明再一目的是提供含有上述引物的试剂盒。

本发明又一目的是提供一种检测试样中牛源性成分含量的方法，用于量化判定待测牛肉产品中牛肉纯度，是否存在掺假行为和掺假情况的严重程度。

本发明所述牛特异性引物是根据牛线粒体DNA中NADH脱氢酶4亚基基因上牛特异性碱基序列设计而成，其核苷酸序列为：

上游引物为：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；

下游引物为：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；

并设计了与上述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：

5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’；其中，F为荧光报告基团，M为荧光淬灭基团。

优选地，F为FAM；M为TAMRA。

为实现本发明目的，本发明还提供一种脊椎动物通用引物和探针，其是根据脊椎动物线粒体DNA（16s rDNA）上的保守序列设计，

上游引物为：5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’；

下游引物为：5’-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’；

探针为：

5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于单重PCR）

或5’-HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’（用于双重PCR）。

本发明进一步提供一种利用上述引物和探针通过单重PCR测定样品中牛肉成分占总肉成百分比含量的方法，具体包括以下步骤：

1）制备待测样品匀浆，提取DNA。

2）提取纯牛肉DNA，稀释至至少5个浓度梯度作为标准品，制作标准曲线，浓度跨度范围可根据实际需求调整，提取过程与1）同步，或事先制备好。

3）单重PCR，采用上述牛特异性引物和探针，通用引物和探针（F为FAM）对步骤1）和2）获得的DNA模板，在1个PCR板上的不同反应管同时进行PCR扩增，按照表1进行加样，PCR过程在1个通道收集荧光信号；然后按照公式1计算出待测样品中牛源性成分的百分含量。

表1单重PCR 96孔板加样方案