[发明专利]一种采用流式细胞术检测发酵过程中细胞活性的方法

说明书

技术领域

一种采用流式细胞术检测发酵过程中细胞活性的方法，属于生物工程领域，特别是在工业化生产中这种方法方便可靠。

背景技术

生物发酵法具有污染小、一般以葡萄糖为底物、成本低等优点，是一条极有发展前景的方法，因此近年来人们把目光聚焦到生物发酵法的研究上。然而，温度、pH、饥饿等多种压力因素会使细胞的活性降低甚至自溶，影响产量。因此，建立简便、快速、可靠的细胞活性检测方法对发酵生产具有实际意义。

目前检测微生物细胞活性的常规方法有菌落计数法、美蓝染色法、比氧消耗速率检测法等，这些方法均具有操作复杂、检测灵敏度差和耗时等缺点。近年来，流式细胞术(flowcytometry，FCM)作为一种有效的且有价值的方法常常用来替代常规方法检测微生物活性。流式细胞仪可以一次性检测细胞群体中的几千个细胞，使研究人员建立个体细胞在群体中的多维表象，自动化程度高，每次检测能获得非常大的信息量。然而，该技术在发酵过程中细胞活性检测方面的报道还比较少，处于研究阶段。

发明内容

本发明的目的是发酵过程中提供一种简便、快速、可靠的细胞活性检测方法。

本发明的技术方案：

一、细胞培养与预处理

1、PI单染时细胞活性标准的检验

①发酵培养至细胞生长对数期，约取1ml发酵液共3管；

②取其中1管放置沸水中加热8-10min后冰浴，编号为1，另两管放在室温中，分别编号为2和3；

③从1和2号管中取500ul发酵液至4号管中，混匀；

④一定大小的孔径网格过滤1、3、4管发酵液；

⑤发酵液离心，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞；

⑥取10⁵-10⁶细胞离心，弃上清，加入PBS，轻轻重悬细胞；

⑦加入一定浓度碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光反应5-10min后冰浴。用流式细胞仪检测。

2、高盐胁迫下的细胞活性

1)高盐下PI单染时的细胞活性

实验方法参照1。

2)高盐下Rh123/PI双染时的细胞活性

①发酵培养至细胞生长对数期，约取1ml发酵液

②发酵液离心，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞；

③取10⁵-10⁶细胞离心，弃上清，加入PBS，轻轻重悬细胞；

④加入450μL PBS和50μL Rh123工作液，混匀，室温避光反应10min，离心并收集菌体；

⑤PBS洗涤细胞两次后PI染色，混匀，室温避光反应5min，立即进行流式上机检测。

2、流式细胞仪检测

将染色好的样品放入上样管，用FL1和FL3通道检测荧光强度信号，调好电压，得到FCM图谱。图谱中R1区表示死细胞，R2区表示活细胞，R3区表示凋亡细胞。

附图说明

图1PI单染时FCM图(A：未处理的细胞样品；B：加热致死的细胞样品；C：各50％的A和B的细胞样品)

图2高盐下PI单染和Rh123/PI双染时的FCM图

具体实施方式

以下是光滑球拟酵母摇瓶发酵时流式细胞仪检测细胞活性的实施例。

光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019，硫胺素、烟酸、生物素和吡哆醇四重维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为本研究室选育，主要用来发酵生产丙酮酸，该菌种已申请中国专利，申请号为：02113142.2，公开号为：CN1392246A。

种子培养基(g/L)：

葡萄糖30，大豆蛋白胨10，KH₂PO₄1，MgSO₄·7H₂O 0.5，用6mol/L HCl调节培养基初始pH为5.5。自来水定容。

摇瓶发酵培养基(g/L)：

葡萄糖100，尿素7，CH₃COONa 3，KH₂PO₄3，MgSO₄·7H₂O 0.8，微量元素液10mL，维生素液10mL，pH 5.5。自来水定容。高盐胁迫时，发酵培养基中添加70g/L NaCl。