[发明专利]传染病病原体全人源化抗体的制备方法

权利要求书

1.一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）传染病病原体抗原的制备：以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；

（2）抗体的标记：将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；

（3）B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；

（4）标记抗原与特异性B细胞的结合：将步骤（2）中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤（3）中的B细胞进行特异性结合；

（5）抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；

（6）扩增抗体可变区基因：采用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:58所示系列特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；

（7）构建表达载体：将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；

（8）重组抗体表达与纯化：以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。

2.一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）外周血B细胞的富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核细胞，采用密度梯度离心纯化；

（2）B细胞分离：由流式细胞仪直接分离单个B细胞；

（3）B细胞特异性鉴定：对流式细胞仪单个B细胞的上清液首先进行功能性的鉴定，筛选出具备特异性的单个B细胞；

（4）扩增抗体可变区基因：采用一系列特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从上述具备特异性的单个B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；

（5）构建表达载体：将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；

（6）重组抗体表达与纯化：以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。

3.根据权利要求1或2所述的传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，在权利要求1所述步骤（3）或权利要求2所述步骤（1）中，当B细胞数量较低时，采用抗CD19磁珠富集B细胞。

4.根据权利要求1或2所述的传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，权利要求1所述步骤（6）或权利要求2所述步骤（4）的具体操作过程为：cDNA合成在96孔板15ul反应体系中进行，采用150纳克的随机六聚体引物、0.5微升的10mM的dNTP混合物及50 U逆转录酶，反转录反应在42℃下进行10分钟，25℃下为10分钟，50℃ 60分钟，最后94℃ 5分钟；IgH, Igλ和Igκ轻链可变区基因采用巢式PCR分别扩增，PCR反应在96孔板50微升体系中，每孔含20nM的每个引物或引物组合，300 nM dNTP和1.2 U HotStar?Taq DNA聚合酶，巢式PCR扩增45个循环，94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃下为55秒。

5.根据权利要求1或2所述的传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，权利要求1所述步骤（7）或权利要求2所述步骤（5）的具体操作过程为：在克隆之前，对上步所得PCR产物首先采用PCR纯化试剂盒进行纯化，之后采用相应的限制性内切酶消化，然后克隆入含有多克隆位点的Igγ，Igκ或Igλ轻链的恒定区的载体中，连接反应的总体积为10微升，含1 U T4 DNA连接酶，7.5微升纯化的PCR产物和25 ng的线性化载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，含有正确克隆的细菌在培养液中培养16小时，离心收集细菌采用质粒DNA纯化试剂盒纯化DNA。