[发明专利]传染病病原体全人源化抗体的制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及抗体的制备技术领域，具体涉及一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法。

背景技术

 单抗药物发展经历了鼠源性单抗，嵌合性单抗、人源化单抗和全人源化单抗四个阶段。1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，形成杂交瘤（hybridoma）细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。经过杂交瘤技术得到的鼠源性抗体，用于人体治疗时存在一些问题。首先，由于鼠源性单抗对于人体是异种蛋白，因此，应用于人体后，很容易引发针对异种蛋白的免疫反应，影响单抗的治疗效果。其次，鼠单抗通常不能有效地激活人体的生物效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDCC)及抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用。此外，鼠单抗在人体内的半寿期也比较短。这些都限制了鼠源性单抗的治疗作用。人源化的抗体可以解决这些问题，通过用DNA 重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中而构建的嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右。表面重塑抗体是通过对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而构建。该方法的原则是仅替换与人抗体表面氨基酸残基（surface amino acidresidues，SAR）差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体SAR 相似的氨基酸替换。重构抗体通过将异源抗体中的抗原结合相关残基与人抗体重新拼接而构建，包括互补决定区（CDR）移植，部分CDR 移植和特定决定区（SDR）转移。近年来最有希望的是全人抗体，即抗体的轻重链都是来源于人的抗体。目前比较成熟的获得全人抗体技术是抗体库筛选技术，主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处, 如从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样性等；而对于核糖体展示技术而言，如何进一步地提高该系统的稳定性，特别是如何防止mRNA的降解和形成稳固的蛋白质-核糖体-mRNA三聚体无疑是该技术的关键问题，如何提高大分子蛋白质在核糖体上的展示也是未来研究需要关注的问题。

发明内容

 本发明要解决的技术问题是提供一种筛选时间短，成本低，无需免疫的传染病病原体全人源化抗体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

首先从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核细胞，通常采用密度梯度离心纯化；当B细胞数量较低时，可采用抗CD19磁珠富集B细胞；重组抗原蛋白在真核或原核细胞中生产纯化，纯化后的抗原蛋白可直接耦合到荧光素异硫氰酸酯（FITC），藻红蛋白（PE），别藻蓝蛋白（APC）或生物素；之后在低温下与B细胞特异性的结合；最后以流式细胞仪分离单个标记的B细胞于96孔板中。或者从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离出单核细胞并纯化后不对抗原特异性B细胞进行任何标记，由流式细胞仪直接分离出单个B细胞于96孔板中，而B细胞的抗原特异性采用其它方法鉴定，如收集上清液测定抗体中和活性等。

其次，RT-PCR扩增重链和轻链的可变区基因。例如，cDNA合成在96孔板15ul反应体系中进行，采用150纳克的随机六聚体引物，0.5微升的10mM的dNTP混合物，及50 U逆转录酶，反转录反应在42℃下进行10分钟，25℃下为10分钟，50℃ 60分钟，最后94℃ 5分钟；IgH，Igλ和Igκ轻链可变区基因采用巢式PCR分别扩增，PCR反应在96孔板50微升体系中，每孔含20 nM的每个引物或引物组合（所用系列引物的序列如表1所示），300 nM dNTP和1.2 U HotStar?Taq DNA聚合酶。HotStar?Taq DNA聚合酶错误率低，适用于单细胞的低拷贝模板的扩增。巢式PCR扩增45个循环，94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃下为55秒。