[发明专利]一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法

权利要求书

1.一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；

cDNA合成采用20μL反应体系，42℃温浴1h；

GS1全长cDNA克隆；

GS2全长cDNA克隆；

利用半定量PCR鉴定小麦GS1和GS2基因表达的方法，通过获得cDNA，利用表1中的引物进行PCR扩增，产物于琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.如权利要求1所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，cDNA合成采用20μL反应体系为：RNA，2μg；M-MLV，200U；dNTP，125pmol；oligodT，100pmol；RNasin，25U。

3.如权利要求1所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，GS1全长cDNA克隆方法为：

GS1全长正向引物GS1QF：5′-CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3′和反向引物GS1QR：5′-CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3′。PCR循环：预变性94℃，2min；变性94℃，45s；退火61℃，45s；延伸72℃，10min；扩增30个循环，4℃，5min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定。

4.如权利要求1所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，GS2全长cDNA克隆方法为：

GS2全长正向引物GS2QF：5’CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物GS2QR：5’-TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’；

PCR循环：预变性94℃，2min；变性94℃，45s；退火56℃，45s；延伸72℃，10min；扩增30个循环，4℃，5min；

PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定。

5.如权利要求1所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，利用半定量PCR鉴定小麦GS1和GS2基因表达的方法为：

通过获得cDNA，利用引物进行PCR扩增：预变性94℃，2min，变性94℃，30s；退火54℃，30s；延伸72℃，30s；扩增28个循环，延伸72℃，5min，产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

6.如权利要求5所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，所述引物设计为：

(1)GS1全长cDNA的引物设计；正向引物GS1QF：5′-CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3′和反向引物GS1QR：5′-CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3′，

(2)GS2全长cDNA的引物设计；正向引物GS2QF：5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物GS2QR：5’-TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’

(3)GS1半定量PCR特异性引物；正向引物5′-TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3′和反向引物5′-CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3′；

(4)GS2半定量PCR特异性引物；正向引物5′-GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3′和反向引物5′-ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3′。