[发明专利]一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于基因克隆与鉴定技术领域，尤其涉及一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法。该基因参与植物氮素同化、转移与利用，为通过转基因方法选育氮高效品种提供了材料。

背景技术

氮素是影响植物生长发育的主要元素，无论是直接来源于硝酸盐、氨离子、微生物固定氮还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶(GS)催化才能同化为氨基酸。大麦、玉米、水稻、拟南芥等许多植物的GS基因已被克隆，GS功能研究已经成为提高氮素利用效率的研究热点之一。高等植物中有两类GS，一类定位于胞液中，称为胞液型GS，即GS1，主要参与种子萌发时储存氮源的转运及叶片衰老时氮源的转移及再利用；另一类定位于质体中，称为质体型GS，即GS2，主要参与光呼吸、硝酸还原产生的氨(初级氮)的同化过程^[。前人研究表明豌豆GS1转化的烟苗在氮胁迫时能提高叶片的光合速率，增加植株的生物产量，促进氮素的转移与再利用(Fuentes，2001)。转GS1基因玉米的穗粒数及千粒重增加，氮素利用率提高(Martin，20006)。高效表达GS1和GS2基因能提高水稻对土壤氮素缺乏的耐性，促进氮的吸收与再利用(孙辉等，2005)。

发明内容

在前期研究工作基础上，我们设计克隆小麦GS1和GS2基因的全长cDNA引物及相应的PCR循环，得到了GS1和GS2基因的全长cDNA。并设计特异性引物，利用半定量PCR鉴定GS1和GS2在小麦不同组织中的表达状态。

本发明实施例是这样实现的，一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，该方法包括以下步骤：

利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；

cDNA合成采用20μL反应体系，42℃温浴1h；

GS1全长cDNA克隆；

GS2全长cDNA克隆；

利用半定量PCR鉴定小麦GS1和GS2基因表达的方法，通过获得cDNA，利用表1中的引物进行PCR扩增，产物于琼脂糖凝胶电泳鉴定。

进一步，cDNA合成采用20μL反应体系为：RNA，2μg；M-MLV，200U；dNTP，125pmol；oligodT，100pmol；RNasin，25U。

进一步，GS1全长cDNA克隆方法为：

GS1全长正向引物GS1QF：5′-CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3′和反向引物GS1QR：5′-CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3′。PCR循环：预变性94℃，2min；变性94℃，45s；退火61℃，45s；延伸72℃，10min；扩增30个循环，4℃，5min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带(图1A)，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定。

进一步，GS2全长cDNA克隆方法为：

GS2全长正向引物GS2QF：5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物GS2QR：5’-TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’；

PCR循环：预变性94℃，2min；变性94℃，45s；退火56℃，45s；延伸72℃，10min；扩增30个循环，4℃，5min；

PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带(图1B)，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP10，挑选阳性菌落测序鉴定。

进一步，利用半定量PCR鉴定小麦GS1和GS2基因表达的方法为：

通过获得cDNA，利用引物进行PCR扩增：预变性94℃，2min，变性94℃，30s；退火54℃，30s；延伸72℃，30s；扩增28个循环，延伸72℃，5min，产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

进一步，所述引物设计为：

(1)GS1全长cDNA的引物设计；正向引物GS1QF：5′-CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3′和反向引物GS1QR：5′-CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3′，

(2)GS2全长cDNA的引物设计；正向引物GS2QF：5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物GS2QR：5’-TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’