[发明专利]重型血友病A致病基因突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与生物医药领域，具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子1倒位突变的试剂盒。 

背景技术

血友病A（hemophilia A，HA）又称甲型血友病，是最为常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，其主要病因是由于凝血因子VIII（FVIII）基因突变而引起的FVIII含量不足或功能缺陷。HA患者常自发性或外伤性出血不止，出血可发生在任何部位，但以关节出血最为多见。反复多次关节出血可导致患者致残，甚至危及生命。临床上根据患者血浆FVIII促凝活性及症状严重程度将HA分为重型、中型和轻型，其中50%为重型。 

我国HA的发病率在男性人群中约为1/5000。血友病根据所缺乏凝血因子的不同分为血友病A和血友病B（hemophilia B，HB），HA约占全部血友病的80%-85%，HB则约占15%-20%且在临床上通常为中型和轻型。HA的人群患病率无种族和地区差异，可能与较高的基因自发突变率相关。由于是X连锁隐性遗传，女性HA患者及其罕见。 

FVIII基因全长186kb，位于X染色体长臂远端（Xq28），含有26个外显子和25个内含子，编码2351个氨基酸。随着人们对HA分子基础的认识不断深入，该病基因诊断的技术也得到了很大发展。截止2012年已经报道基因突变1400多种，主要是点突变、插入、缺失和倒位，其中内含子22倒位（Inversion 22，Inv22）突变约占全部重型血友病A的45%。1996年，Brinke等在一对同卵双生的重型HA双胞胎患者中第一次发现了FVIII基因第1号内含子倒位（Inversion1，Inv1）突变，在大样本重型HA患者中进行了该倒位的筛查，发现第1号内含子倒位是重型HA中仅次于第22号内含子倒位的突变热点。约50%的重型HA患者是由于内含子22倒位和内含子1倒位突变造成，这是近年来HA发病机制中重要的进展。 

目前血友病规范化诊断已建立了包括临床诊断、家系调查、实验检测等系列技术平台。实验检测分为基因诊断和非基因间接诊断。目前市场上所有的血友病诊断产品均采用非基因间接诊断，包括活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆凝血酶原时间（PT）、血浆FVIII：C以及FVIII抗原检测等。这些产品可以对HA进行确诊，但无法确定HA患者的基因突变类型更无法检出携带者。因此，开发可以方便、准确诊断HA的基因分型产品，有效应用于产前诊断，对避免重型血友病胎儿出生，减低HA发病率具有重要意义。 

Single tube PCR assay for detection of chromosomal mutations：application tothe inversion hotspot in the factor VIII gene including optional use of subcyclingPCR，该专利由Qiang Liu和Steven S Sommer发明，于2002年公开，专利号为US6355422B1。提出利用长距离PCR（Long Distance PCR，LD-PCR）法检测血友病A内含子22倒位突变。优势：一管PCR法，直接分型检测血友病A患者、携带者和野生型；缺限：成本高昂、耗时长、仅能检测内含子22倒位，检测系统不稳定，试剂需现用现配，无法作为临床检测产品应用。 

由上海佰真生物技术有限公司申请，2011年公开，专利公开号为CN102230002A的中国发明：“血友病致病基因检测试剂盒及应用”公开的技术方案主要针对FVIII和FIX因子外显子区设计PCR和测序引物。优势：同时检测血友病A与血友病B致病基因，覆盖全长序列；缺陷：测序反应耗时长、成本高昂，70%-80%血友病A的FVIII基因突变呈高度异质性，突变形式复杂，测序结果难以分析。 

目前，血友病A基因检测方法主要有： 

LD-PCR法：长距离PCR，一般指扩增片断超过5kb的PCR方法，但反应体系无法满足稳定性和低成本要求。 

Southern blot技术检测HA内含子22倒位，将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，凝胶经碱处理使DNA变性，再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交，根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带，对待测DNA进行分析。操作复杂、灵敏度低，已很少使用。