[发明专利]一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用，本发明属于丙烯酰胺等具有毒素刺激物检测技术领域。

背景技术

丙烯酰胺(acrylamide，AA)，是一种有毒的无色、无味透明固体结晶，沸点为125℃，熔点为84℃～85℃，室温下稳定，熔融或暴露在紫外光下以及氧化条件下易发生聚合反应产生聚丙烯酰胺。动物实验和体外实验证明AA可导致遗传物质改变和癌症。其主要来源食品为薯条薯片，炸透的薯片中AA含量高达12800μg/kg。JECFA根据各国丙烯酰胺摄入量，认为人类平均摄入量大致为1μg/kg·bw/d。

对丙烯酰胺检测方法中比较成熟主要有气相色谱法和液相色谱法，也有通过色质联用技术大大提高了检测的灵敏度和准确度。气相色谱法(GC)：由于AA的热不稳定性，所以在GC检测前需要对AA进行衍生化处理，以改善AA的热不稳定性。很多研究报道了丙烯酰胺非衍生化的气相色谱测定方法，往往操作过程繁琐，且检测限较高。由于GC测定样品中丙烯酰胺需进行溴化衍生，操作繁琐，对衍生技术要求较高，难以掌握采，用液相色谱法(LC)方法不需要衍生，直接对丙烯酰胺进行测定，简化了分析过程，而且测定在常温下进行，克服了热不稳定性食品中丙烯酰胺还是属于痕量物质，在进行GC或者LC分析之前必须进行富集，这样样品的前处理就相对比较复杂。在此基础上发展起来的LC-MS/MS方法，通过保留时间和相对离子强度来确定丙烯酰胺的含量，在化学结构鉴定上具有很高的灵敏性，检测限为20～50μg/kg，可直接分析食品中丙烯酰胺的含量。由于食品中丙烯酰胺还是属于痕量物质，在分析之前必须进行富集，样品的前处理就相对比较复杂，另外各种检测设备比较昂贵，限制了这些方法在分析时间和成本的普及型。

90年代以来，以生物传感器技术为基础的各类生物检测系统迅速兴起，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，并日趋成熟，不断的应用于各类毒素的检测中去。利用丙烯酰胺的神经毒性这一特征，以其靶细胞为检测对象，分析丙烯酰胺与细胞生长状况，做痕量分析。电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器，利用金纳米粒子具有生物固定的作用，同时具有增强电化学电子传递速率的功能，制备电化学细胞传感器。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法。

本发明提供如下技术方案：剥落氧化石墨烯电镀沉积到玻碳电极表面，清洗氮气吹干，在氯金酸溶液中电镀沉积，制备电化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极。在修饰好的电极表面上滴加细胞悬浊液，孵育20～30min，以达到生物固定作用，制得基于化学还原氧化石墨/金纳米粒子自组装细胞传感器。

所述化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极的制备：将1mM HAuCl₄溶解于0.5MH₂SO₄中，配置0.05mM的HAuCl₄溶液，将Hummers氧化制备的氧化石墨烯，用PB缓冲液配置成0.5mg mL^-1的氧化石墨烯溶液。分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面，滴加细胞悬浊液，在CO₂细胞培养箱中，37℃孵育，制备得到自组装电化学细胞传感器。

所述丙烯酰胺毒素检测标准曲线制作方法如下：取出已修饰完成的细胞传感电极，依次滴加10μL不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激后的细胞PBS悬浊液，37℃孵育20～100min后，采用微分脉冲伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极表进行表征。

玻碳电极清洁方法如下：将玻碳电极(Φ＝2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0.3，0.05μm的Al₂O₃抛光粉将电极表面抛成镜面，再用1：1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4℃备用；

在修饰好的电极表面上滴加10μl 1.6×10⁶个/ml的细胞悬浊液，CO₂细胞培养箱中，37℃孵育20～100min，制得基于化学还原氧化石墨/金纳米粒子自组装细胞传感器。

上述细胞浓度为1.6×10⁶个/ml时，所呈现的线性比例最好，若细胞浓度过高，则会需要对细胞进行富集，影响细胞的生长形态；若细胞浓度过低，则会导致对丙烯酰胺等其他具有细胞侵害作用的毒素检测范围减小。