[发明专利]一种用于过敏原检测的L半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于电化学L半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用，本发明属于C48/80等具有致敏性质的致敏原检测技术领域。 

背景技术

近年来，伴随人们饮食面的快速拓宽，食物过敏的发病率和流行情况日益增加，特别是随着转基因食品的出现，食物过敏将更趋于多样化、复杂化和严重化。因此，对食品过敏原的安全性评价已经成为食品安全研究领域中一个重要的课题。目前，已确定的过敏性食物多达180种以上，联合国粮农组织报告了90％以上食物过敏原存在于牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类水产品、花生、大豆、坚果类及小麦8大类食物中。 

食品的过敏原是国内外检测、监控的一个重点、难点。根据检测目标物的不同，食物过敏原(Food allergen)检测技术主要有以下几种：分析全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的质谱技术、检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)技术、分析过敏原性的免疫学检测技术。实验动物作为食物过敏原的体外评价模型已见报道，但是目前国际上尚未建立起利用肥大细胞作为体外评价模型的方法。肥大细胞是诱发食物过敏的中心枢纽，它在受抗原刺激后脱颗粒直接导致一系列过敏症状的产生，如能建立起肥大细胞体外评价模型并构建传感器，将会比研究动物模型和常规检测手段更直接、更快捷。检测肥大细胞在体外的脱颗粒时，常用的检测成分是组胺、β-己糖胺酶、类胰蛋白酶，但这三者检测手段落后、没有统一的实验方法、所用指标各异，再加上操作繁琐，检测灵敏度低下，容易造成很大的测量误差，限制了这些方法在分析致敏原的普及型。 

为了克服传统检测方法的弊端以及对致敏原检测模型构建的抽象简化，采用致敏原标准物C48/80作为检测对象。C48/80是N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物，具有促进组胺释放的作用。在生化研究中常被作为致敏原的标准物用于促肥大细胞脱颗粒。利用C4/80的致敏性这一特征，以P815肥大细胞细胞为检测介质，通过电化学信号检测C48/80为代表的致敏原对细胞生长状 况的影响，并进行定量分析，从而达到快速检测过敏原的目的。此外为了保持细胞在检测过程中的活性以及克服传统方法的弊端，采用鼠尾I型胶原包裹细胞形成3D培养机构，模拟细胞生存环境，提高了细胞粘附力和生命力，为延长传感器的使用寿命打下了坚实基础。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于电化学L-半胱氨酸/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件。 

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

通过电沉积和自组装方法将纳米金和L-半胱氨酸材料修饰到金电极上；采用P815肥大细胞作为传感介质，利用鼠尾I型胶原包裹细胞形成胶原/细胞3D培养，并将细胞胶原复合物接种到L-半胱氨酸/纳米金修饰电极完成细胞传感器的构建，最后将制备的传感器应用于致敏原标准物C48/80的检测. 

具体步骤为： 

(1)金电极上纳米金的电沉积和L-半胱氨酸的自组装修饰； 

(2)肥大细胞的培养和鼠尾I型胶原的制备； 

(3)胶原/细胞3D复合物的制备以及在电极上孵育； 

(4)过敏原标准物C48/80的检测。 

本发明制备的肥大细胞细胞电化学传感器检测致敏原相比传统方法具有如下优势：作为传感介质的肥大细胞本身就属于免疫系统，当细胞接触志敏物质时会发生强烈的免疫反应，表现为形态上发生脱颗粒现象，细胞释放其内容物如组胺、β-己糖胺酶、类胰蛋白酶等，因此将肥大细胞作为检测过敏原的介质来构建传感器将会大大提高检测的灵敏度和反应速度；其次通过将细胞和胶原混合形成3D结构固定在电极上，胶原不仅提高了细胞在电极上的粘附力而且可以形成网孔结构将细胞保护在其中，使细胞在后续的测试中既能保持活性又防止脱落； 

最后采用电化学测定阻抗来作为检测的信号，不仅提高了检测的灵敏度而且加快了检测的速度，克服了传统方法的弊端，真真正正实现了对过敏原的快速检测。 

附图说明：

图1：电化学细胞传感器构建的流程图 

图2：金电极表面修饰表征循环伏安图(A)和交流阻抗图(B) 

a裸电极；b纳米金修饰后金电极；c L-半胱氨酸/纳米金修饰后金电极； 

d细胞胶原复合物/L-半胱氨酸/纳米金修饰后金电极 

图3：修饰电极表面细胞SEM扫描电镜图 

图4：C48/80标准物的检测交流阻抗图 

具体实施方式

实施例1电化学细胞传感器的制备