[发明专利]核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立及鉴定方法

权利要求书

1.一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、根据Fut8基因序列，设计1条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列：

CUGAUCACU CCAGCAGAGA（759-778）；

并设计Fut8siRNA双链短发夹结构：

siRNA-sense:

5′-GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3′;

siRNA-antisense:

5′-CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3′

S2、将该条Fut8siRNA片段重组到逆转录病毒质粒pSINsi-hU6中，构建pSINsi-hU6-Fut8siRNA载体；

S3、Fut8基因沉默细胞模型的建立，包括如下分步：

S31、用脂质体转染法将pSINsi-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho载体，pGP载体共同转染293T细胞，包装携带有pSINsi-hU6-Fut8siRNA的逆转录病毒；

S32、将3-5×10⁴靶细胞进行9-12h培养，利用7-10ug/mL polybrane孵育后，通过病毒感染方式将Fut8siRNA转染至靶细胞内；

S33、用400-1000ug/ml G418进行筛选，并挑取单个细胞，进行扩大培养，获得稳定的Fut8基因沉默细胞模型。

2.根据权利要求1所述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，步骤S31中的的脂质体与pSINsi-hU6-Fut8siRNA、pE-ampho载体、pGP载体的摩尔浓度比例为4-5：1.5-2：1-1.5：1-1.5。

3.根据权利要求2所述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，其特征在于，步骤S32中病毒液与细胞培养液之间的比例为1-2:10。

4.一种针对上述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的检测方法，其特征在于，实时定量PCR鉴定，其中，所述实时定量PCR的引物序列为，

sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG，

antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。

5.一种针对上述核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型酶活性的检测方法，其特征在于，利用HPLC法测定Fut8酶活性，细胞裂解液蛋白含量为0.2-0.5mg,反应时间为2-5小时。