[发明专利]核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物学功能研究领域，更具体地说，涉及一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型建立方法。

背景技术

核心岩藻糖基化是普遍的蛋白质翻译后修饰过程。Fut8是修饰核心岩藻糖基化的唯一的糖基转移酶（如图8所示），能够调节蛋白质的空间结构和生物学功能，如分子间相互作用、细胞与细胞间的相互识别、蛋白质的正确定位、细胞信号传导等。Fut8^-/-小鼠有肺气肿表现型，这是因为转化生长因子1受体上的核心岩藻糖基缺损则降低TGF 1与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶（MMP）的表达，引起肺气肿病变；Fut8基因敲除导致细胞表面的血管内皮生长因子受体表达量下降。另外，Stubbs等发现核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的N-糖链的分子构象和柔软性。

目前常用的方法是利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)或基因敲除方法，抑制该基因表达，观察相应功能的丢失。基因敲除方法既费时间又需要尖端实验设备。RNA i发现为人们提供了特异性阻断基因表达的新策略。RNA i通过在细胞内转染与靶基因相同序列的21bp的双链RNA,即可使靶基因降解,而且具有特异性强、抑制效率高等特点。目前常用的siRNA导入方法是利用脂质体导入双链siRNA或含有siRNA序列的载体，但是上述方法存在siRNA进入细胞后容易被降解、在细胞内的效应持续时间短、siRNA表达载体转染效率低等问题。针对这种情况，目前应用较多的是逆转录病毒、腺病毒、脂质体等载体。

目前，有关一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型建立方法的文章及专利如下：

(1)用于失活α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因表达的方法和组合物（专利公开号：CN101883850A）

(2)Methods and compositions for inactivating alpha 1,6fucosyltransferase(FUT8)gene expression(专利公开号：US2009042250(A1)）

(3)Compositon for suppressing the expression of fucosyltransferase(专利公开号：US2009221065(A1))

(4)Wang X,Inoue S,Gu J,et al.Dysregulation of TGF-beta1receptor activation leads to abnormal lung development and emphysema-like phenotype in core fucose-deficient mice.Proc Natl Acad Sci USA.2005,102(44):15791-6.

(5)Stubbs HJ et al.Influence of core fucosylation on the flexibility of a biantennary N-linked oligosaccharide.Biochemistry 1996,35:937-947.

专利1-3发明使用包含锌指蛋白和切割结构域或切割半结构域的融合蛋白来失活FUT8基因的方法和组合物。还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白的细胞。

文章4介绍转化生长因子1受体上的核心岩藻糖基缺损则降低TGF1与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶（MMP）的表达，引起肺气肿病变。

文章5介绍核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的N-糖链的分子构象和柔软性。

目前，Fut8siRNA复制缺陷型重组逆转录病毒构建Fut8基因沉默细胞模型的研究尚无报道。

发明内容

本发明利用重组逆转录病毒载体构建了pSINsi-hU6-Fut8siRNA载体,克服了传统载体的诸多弊端，以稳定表达Fut8siRNA，通过细胞感染的方式快速建立Fut8基因沉默细胞模型，旨在为Fut8基因生物学功能研究奠定基础。

为了达到上述目的，本发明一种核心岩藻糖基转移酶基因沉默细胞模型的建立方法，包括如下步骤：

Step1、根据Fut8基因序列，设计1条21个核苷酸双链Fut8siRNA序列：

CUGAUCACU CCAGCAGAGA（759-778）；

并设计Fut8siRNA双链短发夹结构：

siRNA-sense: