[发明专利]饲用果胶酶DNS检测法

说明书

技术领域

本发明设计酶活检测领域，具体地涉及饲用果胶酶DNS检测法。

背景技术

果胶酶是指能分解果胶物质的多种酶的总称，它在破解植物细胞壁、促进内源酶分泌及消除抗营养因子方面发挥了不可替代的作用，在饲料工业中越来越受到重视。但果胶酶是包含多种组分的复合酶，按作用方式分类可分为：（1）解聚酶：①聚甲基半乳糖醛酸酶Polymethlgalacturonase PMG②聚半乳糖醛酸酶PolygalaturonasePG③聚甲基半乳糖醛酸裂解酶Polymethlgalacturonatelyse PMGL④聚半乳糖醛酸裂解酶Polygalaturonatelyse PGL；(2)果胶酯酶Pectinesterase PE。按底物不同分类可分为：果胶酯酶，果胶酶，原果胶酶。但是目前国内采用的果胶酶检测方法是次亚碘酸法(QB 1502-92)，它存在以下问题：

1、底物无法完全溶解，配制出的底物批次间差异较大，且硫代硫酸钠标准溶液和碳酸钠溶液的稳定性较差，从而导致该方法的重复性很差，有时甚至会出现同一个样品今天能检测出酶活，明天却检测不出酶活的情况，对质量控制造成极大的困难。

2、操作繁琐，所需试剂较多，有效的酶液浓度范围太窄，方法规定滴定差即消耗0.05mol/L硫代硫酸钠溶液（A-B）之差须在0.5-1.0ml范围内，难以控制，经常要多次实验才能准确测出酶活，大大增加了操作时间与难度，且势必会增加实验成本。

3、酶活定义与现行NSP酶国家标准有冲突，一般都定义为：每分钟降解底物生成1μmol产物为1个酶活单位，但该法定义为：每小时降解底物生成1mg产物为1个酶活单位，造成了酶活被高估，造成用户困扰。因此，

因此，果胶酶的检测一直是个难题，现有果胶酶检测方法需要亟待改进。

发明内容

因此，本发明的目的是解决饲用果胶酶活性检测困难，提供一种改进的果胶酶DNS检测法。

根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法，所述方法包括以下步骤：

（1）吸取果胶粉溶液，加入DNS试剂并振荡，在37℃水浴锅中保温30min，再加入稀释的酶液，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度A_B；

（2）吸取果胶粉溶液，加入与步骤（1）稀释同样倍数的酶液混匀，在37℃水浴中精确保温30min，加入DNS试剂，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AS；

（3）酶活计算

酶活X=[(A_S-A_B)×K+C_O]×1000×D_f/30/m/M

X：酶样中果胶酶活力，U/mL；A_S：酶反应液的吸光度；A_B：酶空白样的吸光度；K：标准曲线的斜率；C_O：标准曲线的截距；D_f：稀释倍数；M：半乳糖醛酸的分子量212.15g/mol；m：果胶酶取样量，g或mL，

其中，对于步骤（1）和步骤（2），

果胶粉溶液的pH为3.5；

果胶粉溶液与酶液的体积比为3：1；

在果胶粉溶液与酶液的混合液中，果胶粉的浓度为2.25mg/mL。

根据本发明的方法，对于步骤（1）和步骤（2），在沸水浴煮沸的时间为5min，然后用自来水冷却至室温，加水定容并振荡混匀，10000g离心10min。

因此，根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法，其酶活定义为：

1g酶粉或1mL酶液在pH3.5、37℃下，每分钟从浓度为2.25mg/mL的底物（SigmaP9135）溶液中分解释放1μmol还原物质（表述为半乳糖醛酸）所需要的酶量为一个酶活单位U。

根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法的原理为：

果胶酶能将果胶降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。

根据本发明的饲用果胶酶DNS检测法确定了以下反应体系及反应条件：

反应温度：一般饲用果胶酶最适温度在45-60℃之间，但应用环境（畜禽体温）在37-40℃，检测酶活是为了更好的表示其应用效果，故反应温度应该与实际应用温度保持一致，故选择37℃。