[发明专利]基于SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法

说明书

技术领域

本发明提供一种基于SLAF-seq技术的大规模样品基因分型方法，其核心技术是利用SLAF-seq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，进行标记开发、遗传图谱绘制及全基因组关联分析。 

背景技术

随着具有高通量、低成本、测序错误率低、测序读长短特点的新一代测序技术和生物信息学的发展，使得该测序技术进行高通量标记开发成为可能。SLAF-seq（Specific Length Amplified Fragments sequencing）是一种简化基因组深度测序技术，在高通量测序技术的基础上，利用生物信息学方法对目标物种的参考基因组或已知BAC序列进行系统分析，根据基因组的GC含量、重复序列情况和基因组特点等信息，设计标记开发方案，以保证SLAF标签密度、均匀性、效率和分析的准确性。 

根据基因组特性，利用SLAF-seq技术对大规模样品进行研究，通过数学算法解决传统方法通量低和准确性不高的问题，提高生物学分析的准确性，降低成本，提高效率。目前还未见利用SLAF-seq技术对大规模样品进行基因分型的报道。 

发明内容

本发明的目的是利用SLAF-seq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序的方法，对大规模样品进行研究，通过数学算法解决传统方法通量低和准确性不高的问题，提高生物学分析的准确性，降低成本，提高效率。 

为了实现本发明目的，本发明提供基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其基于SLAFseq技术降低基因组复杂度并进行高通量测序，对大规模样品进行标记开发、遗传图谱图谱、单体型图谱绘制及性状关联分析，包括如下步骤： 

1）对经性状鉴定的各样品的DNA进行检测； 

2）对样品基因组的复杂性进行降低处理，获得复杂性降低的DNA样品； 

3）利用二级引物库中的引物对复杂性降低后的样品DNA进行PCR扩增，使特异性长度片段扩增前后丰度一致； 

4）将扩增后的特异性长度片段连接标准测序接头，利用高通量测序技术进行测序； 

5）对于各样品的测序结果进行比较分析，获得SLAF标记，获得各样品的有效序列；进行遗传图谱绘制或全基因组关联分析。 

其中步骤1）通过琼脂糖电泳检测各样品DNA主带是否清晰，有无降解和污染，通过微量分光光度计如Nanodrop 2000检测DNA的浓度及纯度。 

其中步骤5）是对上述SLAF标签进行多态性分析，对存在多态性的标签中的所有样品进行基因分型，并使用自主研发打分体系进行打分，设置阈值，最终获得SLAF标记；通过上述步骤获得的SLAF标记，可用于遗传图谱绘制、全基因组关联分析。 

前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述大规模样品是植物、动物或微生物。 

前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述大规模样品为自然群体、遗传分离群体；所述遗传分离群体为经鉴定的性状分离群体，包括F2、BC1、DH等目标性状分离的群体。 

DNA复杂性降低方法是任何有选择性的减少基因组复杂度的方法，包括限制性内切酶酶切产物PCR扩增或酶切产物选择性吸附。 

其中最佳酶切方案需满足以下条件：a）保证序列标签在基因组上分布尽可能均匀；b）选择特定长度的酶切片段能够保证序列标签的数量；c）选择特定长度的酶切片段避免落在基因组高度重复区。 

其中最佳酶切方案确定需进行预实验，步骤及满足条件如下：1）通过生物信息学模拟，获得1~3套候选方案；2）对样品进行酶切连接、PCR扩 增及琼脂糖凝胶电泳；3）电泳结果各样品目标范围内无特异条带，且通过BMP图片解析软件如bmp2txt获得电泳胶图上各位点灰度值，利用灰度值模拟模板量进行扩增倍率分析，模板范围扩增倍率一致性高者即为最佳方案。 

前述的基于测序和SLAFseq技术的大规模样品基因分型方法，其中所述步骤3）二级引物库是为了利用高通量测序特点，节约测序成本，特为大样本量项目设计的扩增引物，后文中称二级引物，所述二级引物差异序列长度为3~7bp，通过生物信息学方法对ATCG组合进行相似性评估，剔除相似度高序列，保障组合内序列完全识别。所述的二级引物库中的引物序列如SEQ ID NO 4~112所示。