[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：包括含有1至2对引物的扩增反应液；所述的引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’                            SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’                         SEQ ID NO:12

F2:5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’      SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’          SEQ ID NO:14。

2. 根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：所述的扩增反应液还含有选自下组的检测探针：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’                         SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’                   SEQ ID NO:22。

3. 根据权利要求1或2所述的罗氏沼虾野田村病毒检测试剂盒，其特征是：还含有阳性对照品；所述的阳性对照品的核苷酸序列为：

gatatg ttcctgcagt acccaatact ttagcttgcc aacttattgg ttacatcgat acagatccac tagatgaccc taacgttatc ctcgatgttg atcagttact taggcaggct acgtcacaag tgggtgcgcg gcagtggaat ttctctgata caacaactat tccattgatt gtcaggcgtg atgatcaatt gtactatact ggtcaagata aagagaatgt tcgtttctct caacagggtg tattttacct cttgcaagtg a                          SEQ ID NO:3。

4. 罗氏沼虾野田村病毒检测方法，其特征是包括下列步骤：

抽提步骤：抽提样品的RNA；

扩增步骤：用含有1至2对引物的扩增反应液扩增模板；在同一个PCR管中进行扩增产物与检测探针的杂交；

检测步骤：检测杂交结果；

所述的引物选自下组：

F1:5’-tagatatgttcctgcagtacc-3’                            SEQ ID NO:11

R1:5’-tcacttgcaagaggtaaaat-3’                         SEQ ID NO:12

F2:5’-acttgtgacgtagcctgcctttttgatacaaatccactagatgacc-3’      SEQ ID NO:13

R2:5’-cgcggcagtggaatttctctttttgatcatcacgcctgacaa-3’          SEQ ID NO:14

所述的检测探针选自下组：

F3:FITC- 5’-catcgaggattacgttgg-3’                         SEQ ID NO:21

R3:BIOTIN-5’-gcttgccaacttattggtt-3’                   SEQ ID NO:22。

5. 根据权利要求4所述的罗氏沼虾野田村病毒检测方法，其特征是所述的抽提步骤包括如下步骤：

（a）取样品0.02~0.2g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；

（b）取上述体积为N的浆状的样品中加入1~2N体积的裂解液和0.01N体积的蛋白酶K溶液，60℃水浴5~30分钟；

（c）将上述样品液转移至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（d）加入0.2~1毫升样品清洗液至样品富集柱中，6000~12000RPM离心1~5分钟，弃滤液；

（e）加入0.2~1毫升核酸洗脱液至样品富集柱中，静置1~5分钟，6000~12000RPM离心1~5分钟，收集滤液；

（f）取3~6微升滤液加入到含有扩增反应液的PCR管内，将PCR管置于55~65℃条件下保温40~70min；

（g）取3~6微升反应产物加到检测试纸条样品垫上，滴加2~4滴缓冲液，室温静置1~5分钟观察结果。