[发明专利]一种人类PMSCS体外免疫调控淋巴细胞分子机制的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及免疫学领域，特别涉及一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法。

背景技术

协同共刺激分子在T淋巴细胞的活化增殖中起到很重要的作用。“协同刺激信号”是1970年由Bretseher和Cohn在T细胞活性双信号模型的基础上提出的，

即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第一个信号外，还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用，达到生理活化阈值后才能使T细胞产生正常的免疫调节机制。如果缺乏协同共刺激分子的第二信号，将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。B7家族是唯一能从APC单向传送信号至T细胞的协同共刺激分子，PD-L1是B7家族一个重要的负性协同刺激分子，抑制T细胞的活化增殖，在机体免疫应答中发挥了重要的调节作用。

以往的实验已经验证了PMSCS低表达HLA-DR，并对活化的T细胞具有抑制作用，但PMSCS是否表达与T细胞活化或抑制相关的协同刺激分子以及其中的机理，未见相关的文献报道。以负性协同刺激分子PD-L1为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、³H-TdR掺入法、ELISA等实验分析PD-L1在PMSCS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证PD1-PD-L1分子通路是PMSCS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。

发明内容

本发明提出一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，首先在体外分离及培养人PMSCS,应用免疫荧光染色方法检测PMSCS表面负性协同刺激分子PD-L1的表达，通过PD-L1mAb阻断实验，PMSCS与T细胞体外共培养观察T细胞增殖及细胞周期、细胞因子分泌情况等证实其对T淋巴细胞的抑制作用及内在的分子机制，整个验证过程将包括如下步骤:

S1：PMSCS分离培养与鉴定；取足月剖腹产胎儿的胎盘(按医院规定，并经家属同意)，取胎盘胎儿面的蜕膜组织，用HankS冲洗3次，去除血迹，将胎盘组织剪成1mm³,-一2mm³碎片，加入0．1％Ⅳ型胶原酶，37℃水浴消化30min，用DMEM中和并充分吹打，过100目筛网、研磨、收集细胞悬液，以1200rpm／min离心5min，加入完全培养基(含L-DMEM，10％FBS)，置于37℃、5％C02、饱和湿度的C02培养箱培养，每3-4d进行换液，待细胞生长铺满至瓶底80％-90％时传代，以后按常规方法传代、冻存。培养三代以后的细胞用于实验。用于实验之前的细胞进行流式细胞仪检测细胞表型，先将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS液调整细胞浓度为1x10⁶／ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29．FITC、CD34一FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。

S2：免疫荧光染色法检测PMSCS中PD-L1表达；将以多聚赖氨酸处理的盖玻片置于六孔培养板中，取3代以后的细胞种于此六孔板中。1～2d后吸取培养基，加入4％的多聚甲醛固定细胞，用PBS冲洗后，加入抗人PD-L1mAb后置于湿盒中4°C过夜，冲洗后再加入PE荧光二抗，置室温1h，最后加入Hoechst33258五分钟。用50％甘油封片，用荧光显微镜观察。

S3：PD-L1mAb阻断PMSCS对T细胞增殖的抑制作用检测；将3代后的PMSCs用丝裂霉素(10ng／ml)处理，PBS洗三遍，接种于96孔板中1x10⁴／孔，每孔加入T细胞1x10⁵／孔，同时加入PHA(50μg／ml)，实验分为8组：T、T+PHA、T+PHA+PMSCs、T+PHA+PMSCs+antiPDL1、T+PHA+PMSCs+mlgG组；PBMC1、PBMC2、PBMC1+PBMC2、PBMC1+PBMC2+PMSCs、PBMC1+PBMC2+PMSCs+PD-L1、PBMC1+PBMC2+PMSCs+mlgG将细胞于37°C、5％C02条件下培养72h。在结束前18h加入³H-TdR(1μCi／孔)，收集细胞，用β液体闪烁计数仪检测cpm值，根据cpm值的大小，进行分析比较。

S4：PMSCS与T细胞体外共培养及PD-L1阻断实验；取三代后的PMSCs，用10ug／ml的丝裂霉素处理1h，胰酶消化，洗涤5遍，用含