[发明专利]一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测微量氯羟吡啶的器具，特别是涉及一种饲料和动物源性食品中氯羟吡啶残留分析的胶体金层析检测试纸条或卡。

背景技术

氯羟吡啶(CLOP)，商品名为克球酚，化学名为3，5-二氯-2，6-二甲基-4-羟基吡啶，是一种预防畜、兔球虫病的饲料药物添加剂，长期使用或不按规定用药会造成氯羟吡啶在动物体内和组织中残留，具有一定的致畸性和胚胎毒性。现在，欧盟、美国、加拿大、日本以及中国、中国台湾都规定了各种动物组织中氯羟吡啶残留最高限量标准。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为0.01mg/kg。

组织中氯羟吡啶的检测方法主要采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气谱/质谱联用法(GC/MS)等。气相色谱相对麻烦，高效液相色谱法具有简便快速、灵敏的特点，成为分析鸡肉组织中氯羟吡啶残留的主要方法。我国规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为0.01mg/kg，而相应标准的检测限为0.05mg/kg，无法满足检测要求。同时，在样品处理过程中，需先经葡聚糖凝胶阴离子交换柱去除干扰杂质，再过碱性氧化铝SPE柱，不仅过程繁琐，而且降低了的回收率。

理化分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。酶联免疫吸附法(ELISA)法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测定吸光值(OD)值进行结果判定。缩短了检测时间，可以对残留药物进行定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内现处在研发阶段，进口国外产品价格昂贵，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。

发明内容

本发明的目的是：研制出特异、敏感、快速、简便的氯羟吡啶残留胶体金层析检测试纸条和试纸卡。

一种氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、玻璃吸水垫，所述金标结合垫为吸附有胶体金标记的抗氯羟吡啶单克隆抗体或多克隆抗体玻璃纤维棉，在所述硝酸纤维素膜上有用氯羟吡啶-载体蛋白偶联物印制的隐形检测线，用山羊抗小鼠IgG印制的隐形对照线。

所述的氯羟吡啶胶体金层析检测试纸条或卡，所述的隐形检测线和隐形对照线平行排列组合为“||”。

所述的试纸条或卡，所述金标物结合垫为：将1∶100～1∶500稀释(体积比)的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃低温真空干燥，制备CLOP金标物结合垫。

所述的试纸条或卡，所述胶体金标记抗体制备方法为：将稀释后的胶体金和单克隆抗体或多克隆抗体按照不同的浓度倍比，选择胶体金显色红色的最小稀释浓度作为胶体金标记抗体的最佳量，用于胶体金标记抗体的制备。

所述的试纸条或卡，所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为：

A1、氯羟吡啶半抗原的改造：亲核取代反应引入酯键，然后在碱、酸的作用下，合成含有羧基的氯羟吡啶半抗原；

A2、CLOP-2C-载体蛋白人工抗原的合成：采用活泼酯法合成CLOP人工免疫原，称取75mg CLOP半抗原溶解于3mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入二环己基碳二亚胺35mg和N-羟基琥珀酰亚胺18mg，在室温下磁力搅拌反应过夜12h，此液为A；称取20mgBSA溶于2mL 0.01mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶液中，此液为B；将反应液B置于磁力搅拌器上，4℃下将反应液A缓慢滴加到反应液B中，搅拌反应过夜。次日将反应液置于经过预处理的透析袋内，在PBS中搅拌透析7天，得到偶联产物CLOP-2C-BSA，分装上清液，冻存于-20℃冰箱中，备用；

A3、氯羟吡啶单克隆抗体和多克隆抗体的获得：用CLOP-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS₀骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备CLOP mAb；