[发明专利]嗜水气单胞菌核酸标准品的应用

权利要求书

1.一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其特征在于，其包括下述步骤：

CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增；对PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；

所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤：

将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为：启动冻干机，当干燥室温度降至-35℃时开启冷却阱；冷却阱温度降至-40℃时，将在-80℃预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr结束冷冻；并将样品于15℃干燥，当真空度降至0.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20℃中避光贮存。

2.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的基因组核酸的提取方法为CTAB法提取嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的菌悬液DNA，并将提取的DNA用pH8.0的TE溶液溶解，提取的样品DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，取OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间的样品DNA于西林瓶分装。

3.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的菌悬液培养方法为：

（1）增菌：从嗜水气单胞菌标准菌株接种到LB培养基中，进行发酵，37℃培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，32~37℃培养24~48h，至菌悬液菌含量的终浓度为10⁷~10¹⁰cfu/g；

所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，葡萄糖5g，无需调节pH，121℃下灭菌20min；

（2）洗涤：将步骤（1）获得的菌悬液重复下述清洗操作2~5次，以1:10的体积比与PBS缓冲液充分混合，在8000~12000rpm条件下离心5~10min，收集菌体。

4.根据权利要求1所述核酸标准品的应用，其特征在于，所述的PCR特异性扩增的条件为：

上游引物5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’

下游引物5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3

PCR扩增反应体系（25μL）为：2.5μL的10×缓冲液Buffer；1μL的MgCl2；1μL的dNTPMix；1μL的引物P1（20mM）；1μL的引物P2（20mM）；0.2μL的TaqDNA聚合酶；18.3μL超纯水；

PCR反应条件为94℃预变性10min；然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；并于72℃延伸10min；

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟。