[发明专利]嗜水气单胞菌核酸标准品的应用

说明书

技术领域

本发明主要涉及海产品疾病检测技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用。

背景技术

我国海域辽阔，自然条件优越，海洋资源十分丰富。但目前开发利用的程度还很低。这也说明我国开发利用海洋资源的潜力巨大，辽宁海域是中国重要的海洋生物资源、渔业资源宝库，其盛产水生动物、扇贝、贻贝、牡蛎和鱼、虾以及藻类等，带动海洋经济发展。加强多边和双边的海洋开发国际合作，集中集约开发利用海域及海岛资源，合理配置优势海洋产业，科学高效开发海洋资源，积极开展科研与试验、开发与利用，海水养殖标准化是合理开发海水养殖资源的重要手段，研究制定海产品养殖标准，合理开发海水滩涂养殖资源，提高养殖海产品疾病是当今养殖业的重点内容。海产品养殖是一项高风险的养殖业，传统的小户的海产品养殖给养殖户带来了巨大的市场和技术风险。为了将养殖户养殖风险降到最低，开展对各类养殖业，包括鱼、虾、蟹、水生动物、鲍鱼、贝类、海藻等各类海产品的疾病防治工作任务举足轻重。有报道称，霍乱弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等有害细菌，是引起海产品各种疾病的罪魁祸首。

嗜水气单胞菌（A.hydrophila）广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落园形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。嗜水气单胞菌在水温14.0～40.5℃范围内都可繁殖，以28.0～30.0℃为最适温度。PH值在6～11范围内均可生长；最适PH值为7.27；嗜水气单胞菌可在含盐量0‰～4‰的水生存，最适盐度为0.5‰。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，因嗜水气单胞菌的变异菌株较多，所以要特别注意疗效。

发明内容

由背景技术可见，提高嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的检出率，增强其检测精度是解决多种水生动物病害问题的重要途径。本研究采用以下技术方案实现嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其包括下述步骤：

采用CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增；对PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；

所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤：

将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为：启动冻干机，当干燥室温度降至-35℃时开启冷却阱；冷却阱温度降至-40℃时，将在-80℃预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr结束冷冻；并将样品于15℃干燥，当真空度降至0.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20℃中避光贮存。

对于上述技术方案中所述的样品的核酸提取方法，可以由本领域技术人员根据共知常识确定。

在上述技术方案中，所述的提取样品核酸的方法为步骤（3），所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤：

（1）增菌：从嗜水气单胞菌标准菌株接种到普通LB培养基中，进行发酵，37℃培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，32~37℃培养24~48h，至菌悬液菌含量的终浓度为10⁷~10¹⁰cfu/g；

所述的嗜水气单胞菌培养基，其配制方法如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，葡萄糖5g，无需调节pH，121℃下灭菌20min；冷却备用；

（2）洗涤：将步骤（1）获得的菌悬液重复下述操作2~5次以清洗，以1:10的体积比与PBS缓冲液充分混合，在8000~12000rpm条件下离心5~10min，收集菌体；

（3）采用CTAB法提取菌悬液DNA；将提取的DNA用pH8.0的TE溶液溶解，获得基因组核酸溶液；其操作步骤参见国家海洋局908专项办公室编，海洋生物生态调查技术规程，海洋出版社，2006、4,p23-26，于西林瓶中分装核酸样品；