[发明专利]一种枝孢菌株及其微生物菌剂以及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株用富集培养的方法从活性污泥中自行分离得到并能高效降解废水中纤维素的菌株（HRZ008）及其应用。

背景技术

造纸工业是世界6大工业污染源之一，占我国工业废水总量的10%左右。造纸废水中含有大量的纤维悬浮物，其中粒径较大的悬浮物会被格栅或筛网截留下来，用于末端回收；其他的细小纤维则会进入后续的生物处理过程。生物处理可以有效降低纤维素废水的污染负荷，提高废水的可生化性，是一种经济、有效且环保的方法。但纤维素是一种难降解的高分子有机物，它的生物降解依赖于纤维素降解菌的生理过程；因此，如果能筛选到一株对纤维素有较强降解能力的稳定菌株，并将它制成菌剂，投加到废水处理系统中，则可以调节菌群结构、提高微生物活性，从而提高废水中纤维素的降解效率。

在无酶、中性pH的环境中，纤维素的半衰期约为几百万年，因此微生物在自然界的纤维素降解过程中起着举足轻重的作用。随着资源与环境问题的日益突出，开发、寻找能够有效降解、利用纤维素的微生物已成为众多学者关注的热点，从自然界中筛选得到高效降解菌的方法也备受采用。筛选纤维素降解菌常用的方法是从纤维素的富集地采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养或紫外诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。目前，文献报道的纤维素高效降解菌主要分离自垃圾堆肥、土壤、瘤胃、朽木等，而且大多集中在木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、热单孢菌属（Thermomonospora）、链霉属（Ambofaciens）等少数几个属，极少见到从废水处理系统中分离高效降解菌的研究，对于废水中是否存在类似的降解菌、属于哪一种菌、菌的降解能力如何等问题也知之甚少。因此，从纤维素富集的造纸废水处理系统中采集活性污泥，通过富集培养、分离纯化，获得高效降解菌并应用于实践，对于降低纤维素在环境中的污染具有现实意义。

发明内容

本发明目的之一在于提供一株从活性污泥中自行分离得到的枝孢菌株。

本发明目的之二在于提供利用上述菌株制备微生物菌剂的方法。

本发明目的之三在于提供上述方法制备的微生物菌剂。

本发明目的之四在于提供上述枝孢菌株在高效降解废水中纤维素的应用。

本发明所提供的降解纤维素的菌株从A/O工艺反应器的活性污泥中分离得到，是一株具有较高活力、对纤维素有较强降解能力的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，制成菌剂后可以直接用于废水生物处理。将其编号为HRZ008，保藏于4℃冰箱中。该菌株的形态特征为：在查氏酵母膏琼脂培养基（CYA）上生长7天后，菌落呈绒状，有少量沟纹，表面灰绿色，反面黑绿色；分生孢子梗侧生在菌丝上，不分枝，单生，分隔处不缢缩，直立，淡褐色，具孢痕，枝孢0～1个隔膜，分生孢子顶生或侧生，椭圆形，圆柱体，形似球状，淡褐色，平滑，无隔膜，大小为（3.5μm～8.0μm）×（2.5μm～4.1μm）。该菌株的18S rDNA序列(1637bp)已经递交到GenBank数据库。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用BLAST程序与已登录真菌菌株的18SrDNA序列进行比较，结果表明与Cladosporium（枝孢属）相似性最高，同源性高达100%。所述HRZ008菌株的培养方法：将该菌菌体接到菌种保藏培养基上，在30℃下生长3～5d，挑取菌体到活化培养基中，在30℃下培养5d，经离心可以获得该菌株的纯细胞。

上述枝孢属（Cladosporium sp.）HRZ008，由中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏编号是CCTCC No:M2012363，保藏日期为2012年9月19日，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学内。

一种微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌种活化：挑取枝孢菌株HRZ008至菌种保藏培养基，30℃平板划线、挑取单菌落培养两次后，挑取少量接种于活化培养基中，于30℃、180r/min摇床震荡培养24h；

（2）液态发酵：向装有灭菌后的种子培养基中，按照10%的接种量接种枝孢菌株HRZ008，于30℃下，通空气培养48h，得到活菌体发酵液；

（3）菌剂制备：培养好的发酵液经OD₆₀₀测定后，超滤浓缩，调节其吸光度至1.0，加入体积分数50%的甘油保藏即可。