[发明专利]检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种检测雪白丝衣霉菌(Byssochlamys nivea)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTP混合物、MgCl₂和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组成，它们的摩尔比为1:1:1:1混合，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′

下游引物：5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′

荧光探针：5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′

其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

2.一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）提取样品DNA；

（2）以待测样品DNA为模板，与权利要求1所述的实时荧光PCR试剂盒混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于实时荧光PCR仪进行荧光检测；

（3）选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，小于Ct值，则判断为阳性，所述Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

3.如权利2所述的方法，其特征在于所述Ct值为35。

4.如权利2所述的方法，其特征在于所述方法的步骤（2）中PCR体系终浓度组成如下：

  试剂名称  终浓度  PCR反应缓冲液  1×

  MgCl₂  2.0～3.5mmol/L  dNTP混合物  0.2～0.4mmol/L  上游引物  0.2～0.4μmol/L  下游引物  0.2～0.4μmol/L  荧光探针  0.2～0.4μmol/L  DNA聚合酶  1～3U/反应  DNA模板  1～10²ng/μL  溶剂为无菌超纯水