[发明专利]检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒和检测方法。

背景技术

雪白丝衣霉（byssochlamys nivea）是果汁生产过程中易污染的耐热霉菌之一。雪白丝衣霉可产生真菌毒素棒曲霉素/展青霉毒素和丝衣霉酸，真菌毒素对许多生物系统都有毒害作用，可致畸、致癌。被耐热霉菌污染的果汁在贮存过程中易出现变色、异味、分层沉淀等现象，甚至胖听爆裂，出现产品质量问题。

雪白丝衣霉目前主要通过培养法分离，生化方法鉴定，整个过程操作繁琐，检测周期长，不利于生产时的产品监控，以及食品安全事件的应急处理，不能满足果汁产品出口中快速准确检测的需要。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足展开的实验研究，根据雪白丝衣霉的Beta tubulin的部分基因序列设计引物和TaqMan探针，提供一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒，可实现对雪白丝衣霉菌的快速、准确、特异性检测。为此，本发明采用以下技术方案：所述试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTP混合物、MgCl₂和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组成，它们的摩尔比为1:1:1:1混合，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′

下游引物：5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′

荧光探针：5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′

其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。

本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种采用上述实时荧光PCR试剂盒的一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR方法。为此，本发明采用以下技术方案：所述方法包括以下步骤：

（1）提取样品DNA；

（2）以待测样品DNA为模板，与权利要求1所述的实时荧光PCR试剂盒混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于实时荧光PCR仪进行荧光检测；

（3）选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，小于Ct值，则判断为阳性，所述Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案：

所述Ct值为35。

所述方法的步骤（2）中PCR体系终浓度组成如下：