[发明专利]低密度脂蛋白中胆固醇的多重定量方法

说明书

本申请是申请日为2005年3月30日，申请号为200580017679.4的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及同时测量生物样品中作为被分析物的低密度脂蛋白中胆固醇和总胆固醇的方法，特别涉及可以稳定用于测量的液体试剂的方法。

背景技术

低密度脂蛋白（以下称作“LDL”）在血液胆固醇运输中起主要作用，特别是，在动脉粥样硬化病例中血管壁上沉积的绝大部分胆固醇来自LDL。LDL胆固醇的增加是动脉粥样硬化疾病的主要危险因素，因此在临床上对其选择性定量是很有用的。总胆固醇测量包括测量所有的脂蛋白，例如乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL以及高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇，总胆固醇测量仍然是脂类检验的主要项目。

定量LDL胆固醇的常规方法包括一种包含分级分离和胆固醇定量两个操作的方法以及基于总胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯值依照Friedewald方程通过计算的定量方法。

对于分级分离，包括了诸如超速离心、沉淀和免疫学技术的方法。这些方法需要通过离心或过滤处理样品，考虑到便利和经济的原因，很难在实验室检验部门推广应用。基于Friedwald方程的计算方法因不考虑个体变异，所以在精确度上有问题，限制了其使用。

近来，业已报道了不需要分级分离的定量LDL胆固醇的方法（特开平11-318496号公报），其在检验作为临床检验用试剂时适用。该方法包括第一步，选择性除去样品中除LDL外的脂蛋白中胆固醇（“除去”意思是降解酯型胆固醇，并使降解产物在第二步中不被检测到），以及第二步定量LDL胆固醇。

尽管上述用于LDL胆固醇测量的试剂在临床上很有用，但是该试剂并没有得到广泛使用，这是因为一直广泛地进行总胆固醇的常规测量，并且可以通过Friedewald方程等测定LDL胆固醇水平。然而，如上所述，通过Friedewald方程测定的LDL胆固醇水平存在问题，并且，LDL胆固醇水平的精确测量具有临床意义。因此，期望进一步改进该试剂，由此推广使用临床意义高的测量LDL胆固醇的试剂。

另一方面，下述文献中披露了单次测定连续测量HDL中胆固醇和总胆固醇以及LDL中胆固醇和总胆固醇的方法（特表2003-501630号公报）。在该方法中，将样品放入试管中，使样品中非HDL胆固醇和抗apoB抗体之间形成复合物，并测量未参与形成复合物的脂蛋白，即HDL。接着，用表面活性剂解离复合物，并通过酶测定剩余的非HDL胆固醇。可通过将两次测量获得的值加起来得到总胆固醇水平。就LDL胆固醇来说，使用了类似的反应方法，其中在复合物形成时使用的是抗apoA-I或抗apoA-II抗体而非抗apoB抗体。常规测量HDL胆固醇、LDL胆固醇和总胆固醇在医学检查等领域中广泛应用，因此，同时测量HDL胆固醇、LDL胆固醇和总胆固醇很有意义。

专利文件1：特开平11-318496号公报

专利文件2：特表2003-501630号公报

发明概述

本发明的目的是提供一种抑制下述试剂自发显色的稳定化方法，所述试剂用于通过一次测定同时定量LDL胆固醇和总胆固醇。该方法作为一种多重定量方法，其中单次测量就可获得多个项目的定量值。

鉴于最近引起注意的LDL胆固醇的精确测量的重要性，以及通常已知的总胆固醇测量的重要性，本发明人坚持不懈地研究以建立同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的系统。

本发明人已开发了一种能同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的方法（特愿2002-362970，PCT/JP03/15995）。该方法包括在作用于除LDL外的脂蛋白的表面活性剂存在下，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于脂蛋白，通过将所产生的过氧化氢转化为醌染料来测量除LDL外的脂蛋白中胆固醇，随后添加至少作用于LDL的表面活性剂，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于残留的LDL，并通过将所产生的过氧化氢转化为醌染料来测量LDL胆固醇，在此可通过对上述两次测量值求和计算总胆固醇值。该方法是一种有效的多重定量方法，其中单次测量就可获得多个项目的定量值。但是，在该方法中，存在于第一试剂中的、产生醌染料的成分以液体试剂的形式使用，因此该试剂被空气氧化，带来了自发显色和液体试剂缺乏稳定性的问题。

因此，本发明人坚持不懈地针对用于单次测量就能同时定量LDL胆固醇和总胆固醇的试剂的稳定性进行研究，终于找到了一种通过抑制在同时测量LDL胆固醇和总胆固醇的方法中所用试剂自发显色来稳定地测量LDL胆固醇和总胆固醇的可靠方法。