[发明专利]一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法

权利要求书

1.一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将猪2型圆环病毒抗原蛋白的编码基因置于衣藻叶绿体特异表达的启动子和终止子之间，构建抗原蛋白基因的衣藻叶绿体表达盒；2）抗原蛋白基因表达盒与筛选抗性标记基因表达盒相连；3）在相连两个基因表达盒两侧分别连接上衣藻叶绿体基因组中的同源片段，构建成衣藻叶绿体特异表达载体；4）用所构建的载体通过基因枪轰击转化衣藻细胞；5）在含有抗生素的固体培养基中筛选具有抗性的绿色单藻落；6）通过抗性固体和液体培养基的多轮继代培养和筛选，获得外源基因在衣藻叶绿体中完全同质化的藻落；7）通过分子检测筛选出外源抗原蛋白基因在衣藻叶绿体中高效稳定表达的衣藻转化子；大规模培养生产高表达抗原蛋白的衣藻转化子，收集加工，用作猪圆环病毒病口服疫苗。

2.根据权利要求1所述的生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的构建藻叶绿体特异表达载体：

(1)猪2型圆环病毒主要抗原蛋白capsid基因ORF2的克隆：设计两对引物，通过PCR方法扩增编码PCV2抗原结构蛋白capsid基因ORF2；设计的两对引物为：ORF2-P1：5’-TCAAAGCTTGATGACGTATCCAAGG-3’，包含HindⅢ酶切位点；ORF2-P2：5’-GAAGTCGACTCACTTAGGGTTTAAGTGG-3’，包含SalI酶切位点；以质粒pCY7为模板，利用ORF2-P1，ORF2-P2为引物，用pfu DNA聚合酶扩增出PCV2ORF2抗原基因；PCR反应程序为:94℃,1min,55℃,1min,72℃,1min,30个循环；再将ORF2抗原基因克隆到通用测序载体pBluescript SK(+)的HindⅢ和Sal Ⅰ位点之间，构建成测序载体pSK-ORF2，对PCR扩增片段进行测序，测序结果显示与已知序列完全相同；

（2）ORF2基因叶绿体基因表达盒的构建：用NcoI和SalI双酶切质粒pSK-ORF2，回收0.7kb的ORF2基因片段；同时以NcoI和SalI酶切质粒patpX（质粒patpX克隆有衣藻叶绿体atpA基因5′端启动子PatpA、rbcL基因3′端终止子TrbcL和一组多克隆位点），将0.7kb的ORF2融合基因插入patpX的衣藻叶绿体PatpA启动子和TrbcL终止子之间，构建成含有ORF2基因的衣藻叶绿体表达盒，得到质粒paptX-ORF2；

（3）衣藻叶绿体叶绿体转化载体：将paptX-ORF2经EcoRV和NotI酶切产物补平后，得到PatpA-ORF2-TrbcL的ORF2基因表达盒，将其插入EcoRV酶切的p64D（质粒p64D含衣藻叶绿体特异表达的aadA表达盒及同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2,并在chlL5′和chlL3′之间引入多克隆位点EcoR V,BamH I,Sac I,Avr II及Bsm I）载体中，最终得到的衣藻叶绿体表达载体p64CAP，含有ORF2基因表达盒和aadA基因表达盒及两侧的衣藻叶绿体同源重组片段clpP-trnL-petB-chlL5’和chlL3’；

所述的衣藻叶绿体特异启动子为atpA5’；终止子为rbcL3’；ORF2基因表达盒为PatpA-ORF2-TrbcL；aadA表达盒为PatpA-aadA-TrbcL；所述的同源重组片段为衣藻叶绿体基因组中的clpP-trnL-petB-chlL5’及chlL3’。

3.根据权利要求1所述的生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的用所构建的载体通过基因枪轰击转化衣藻细胞：利用包裹有质粒（p64CAP）的金粉子弹轰击受体衣藻细胞，在光下经过25℃，8小时过渡培养后，涂布于抗性筛选TAP培养基上，含Spc 100μg/ml；在25℃，3000Lux的连续光照条件下培养，7~10天后转化平板上出现绿色的藻落即抗性转化子；而空载金粉轰击的野生型衣藻细胞，在抗性筛选TAP培养基，含Spc 100μg/ml上则完全白化并停止生长；挑取单藻落,于50mL液体选择培养基，含Spc 100μg/mL中培养.7d后将TAP液体选择培养基中培养。