[发明专利]一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，主要是一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法。

背景技术

猪圆环病毒病（Porcine Circovirus Disease，PCVD）是主要由猪2型圆环病毒（PorcineCircovirus 2，PCV2）引起的免疫抑制性疾病，表现断奶后仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎和中枢神经系统疾病等，是全球公认的危害养猪业的重要疫病，也是困扰我国养猪业的严重疫病之一。近年来，猪圆环病毒病毒感染率有明显的上升趋势。

疫苗接种是目前预防家猪圆环病毒病的主要途径。猪圆环病毒疫苗包括传统的灭活疫苗、弱毒疫苗及新型的基因工程疫苗。灭活和弱毒疫苗会引起机体相应的体液免疫应答，使接种动物得到短期有效的免疫保护，是目前防治猪圆环病的有效手段。但是其不足之处是灭活疫苗制剂生产设备要求高、工艺复杂、生产成本高及灭活不完全，疫苗存在潜在的安全性问题。而弱毒疫苗在遗传上很不稳定，通过多代遗传后，可能恢复其毒力，并且弱毒疫苗难以达到对各种动物都是弱毒。由于上述原因，猪圆环病毒弱毒疫苗只在少数国家试用，我国农业部已下令停止使用猪圆环病毒弱毒疫苗。猪圆环病毒亚单位基因工程疫苗是一种新兴的疫苗，具有效率高、使用安全、制作工艺简单、生产费用低廉等优点，但目前尚无有效的猪圆环病毒疫苗上市。因此，开发新型的猪圆环病毒基因工程疫苗具有广阔的市场前景，也是本行业科研攻关的重要课题之一。

莱茵衣藻是素有“绿色酵母”之称的一种单细胞真核生物，在衣藻细胞中有一个杯状叶绿体，约占整个细胞体积的40-60%。叶绿体大且仅有一个，并紧贴质膜，这些特点更利于外源基因的转化和稳定。并且其培养方法简单、成熟，培养周期短，生产成本低，生产的药用蛋白不需纯化，可直接作为动物添加饲料，因此是一种理想的生产动物口服疫苗的生物反应器。所以利用衣藻叶绿体基因工程的方法生产PCV2新型疫苗具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的正是要克服上述技术的不足，而提供一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，具体涉及利用衣藻叶绿体基因工程生产可添加到动物饲料中的口服型新型猪瘟圆环病毒疫苗的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，包括以下步骤：1）将猪2型圆环病毒抗原蛋白的编码基因置于衣藻叶绿体特异表达的启动子和终止子之间，构建抗原蛋白基因的衣藻叶绿体表达盒；2）抗原蛋白基因表达盒与筛选抗性标记基因表达盒相连；3）在相连两个基因表达盒两侧分别连接上衣藻叶绿体基因组中的同源片段，构建成衣藻叶绿体特异表达载体；4）用所构建的载体通过基因枪轰击转化衣藻细胞；5）在含有抗生素的固体培养基中筛选具有抗性的绿色单藻落；6）通过抗性固体和液体培养基的多轮继代培养和筛选，获得外源基因在衣藻叶绿体中完全同质化的藻落；7）通过分子检测筛选出外源抗原蛋白基因在衣藻叶绿体中高效稳定表达的衣藻转化子；大规模培养生产高表达抗原蛋白的衣藻转化子，收集加工，用作猪圆环病毒病口服疫苗，添加在饲料中给动物服用，达到动物免疫效果。

衣藻转化子的筛选方法，是引入适当的抗性选择标记基因，使转化子可以在选择培养基上生长，而非转化子则死亡。叶绿体转化的细胞系要保持遗传上的稳定性，必须达到外源基因在衣藻叶绿体基因组中的同质化；衣藻叶绿体转化子通常在高选择（抗生素）压力下经过足够多的细胞分裂后会达到同质化。本发明是以细菌来源的壮观霉素抗性基因（aadA基因）作为叶绿体转化的筛选标记基因；并对衣藻转化子进行壮观霉素（Spc）抗性固体和液体培养基的多轮次筛选，提高衣藻叶绿体转化子同质化程度，通过PCR技术进行同质化程度检测。

ORF2基因是通过同源重组机制，经双交换整合到衣藻叶绿体基因组中，叶绿体遗传转化是将外源基因通过同源片段的双交换，定点整合到叶绿体基因组中。在构建的叶绿体表达载体中，外源基因两侧各具一叶绿体的同源片段，当载体通过基因枪被导入叶绿体时，外源基因也随之插入到叶绿体基因组的特定位点。因此，同源重组片段的合理选择是进行叶绿体遗传转化的关键。本发明是利用衣藻叶绿体基因组中的clpP-trnL-petB及chlL基因片段作为同源重组片段。

本发明方法中，利用的检测技术手段主要有：PCR和Southern blot分子检测技术，用于检测外源基因是否整合到衣藻叶绿体基因组中及外源基因的同质化程度；Westernblot和ELISA技术用于检测外源基因的表达和定量；饲喂小鼠实验，用于检测表达抗原蛋白的免疫活性，以保证制品的质量。