[发明专利]一种制备透明质酸纳米微球的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种利用碱基配对交联制备透明质酸纳米微球的方法。

背景技术

天然多聚糖纳米微球具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。通常，药物在体内代谢较快，而频繁注射给药则会给病人带来极大的痛苦。选择合适的纳米微球体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。在组织工程和再生医学领域，多聚糖纳米微球常用于包埋细胞生长因子和基因，提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力。常用来制备纳米微球的多聚糖包括：透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、壳聚糖、淀粉及纤维素等。

多聚糖纳米微球在制备工程中必须添加化学交联剂处理，其结构才能稳定。这些化学交联剂主要有多聚甲醛、戊二醛、水溶性碳化二亚胺和京尼平等，其作用是将多聚糖分子中的活性基团（氨基、羧基和羟基）经过缩合而达到交联的目的。化学交联剂具有细胞毒性，虽然能使纳米微球在物理结构上比较稳定，但是会导致包埋的活性蛋白类药物（如细胞生长因子等）变性而失活，因此不适合用于活性蛋白的传递，同时交联剂也容易残留在材料中。避免使用有毒的化学交联剂，则有望得到高生物活性的多聚糖纳米微球材料，是降低材料毒性及提高药物输送效率的有效途径。但是，现有技术中尚不存在采用无毒化学试剂交联制备多聚糖纳米微球的方法。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种制备透明质酸纳米微球的方法，避免使用了有毒化学交联剂，可保证被包埋药物的生物活性。

实现本发明目的的技术解决方案为：通过碱基配对作用，采用反相乳液交联技术制备透明质酸纳米微球，具体包括以下步骤：

步骤1、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加胸腺嘧啶盐酸溶液，搅拌反应；

步骤2、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的胸腺嘧啶，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明质酸；

步骤3、室温下配制透明质酸水溶液，加入多磷酸酯，搅拌均匀；滴加腺嘌呤盐酸溶液，搅拌反应；

步骤4、将反应完成后的透明质酸溶液冷却至沉淀析出未反应的腺嘌呤，然后用氨水将上清溶液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，最后将有机溶剂蒸干，得到腺嘌呤功能化透明质酸；

步骤5、分别将上述两种碱基功能化透明质酸溶于石蜡油，各自加入司班80，超声下按比例混合乳化后搅拌挥发过夜；

步骤6、将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，待透明质酸纳米微球析出后进行高速离心，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

本发明所用到的试剂来源：透明质酸、胸腺嘧啶、腺嘌呤，购于Sigma公司；司班80、乙酸乙酯，分析纯，南京化学试剂有限公司；异丙醇、正己烷、丙酮，分析纯，上海化学试剂有限公司；盐酸、氨水，分析纯，上海化学试剂厂。氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司。DMEM培养基，Giboco公司；小牛血清，杭州四季青生物材料工程研究所；青霉素、链霉素，华北制药股份有限公司。

本发明所用到的仪器：扫描电子显微镜（JSM-6330F, JEOL）；纳米粒度分析仪（Malvern Zetasizer Nano ZS）；酶标仪（Biorad，Model 550）；喷金仪（Cressington 108 Auto）。

与现有技术相比，本发明的特征在于：1）避免使用了有毒化学交联剂，因此纳米微球中不存在毒性残留，保证了纳米微球的安全性；2）所涉及的碱基配对基于分子间的氢键作用，不与被包埋活性药物发生化学反应，能有效保护药物的生物活性，特别适用于活性蛋白类药物的包埋与传递；3）本发明工艺和设备简单、易行、操作安全，具有制备温度低、固化速度快、处理周期短、对环境不产生污染等优点，适合商业化生产。

下面通过实施例来进一步说明本发明。

附图说明

图1是透明质酸纳米微球制备示意图。                                                               

图2是成球率与透明质酸中碱基对配比（1/2、1/1和2/1）的关系。

图3是纳米微球的直径与透明质酸溶液浓度的关系。

图4是透明质酸纳米微球的粒径分布与扫描电子显微图。

图5是透明质酸纳米微球在磷酸盐缓冲溶液中的失重。