[发明专利]用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法

权利要求书

1.一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）植物线虫样品的洗涤：在无菌的载玻片上滴无菌去离子水，用线虫挑针挑入单条线虫或单个虫卵；

（2）PCR模板制备：将三蒸水滴到PCR管内壁上，挑入步骤（1）洗涤过的单条线虫或单个虫卵，用无菌昆虫针在体视显微镜下扎破线虫虫体或虫卵，把线虫裂解液甩入管底，该线虫裂解液作为PCR模板直接使用或者放入-80℃超低温冰箱中保存备用；

（3）PCR反应：选取线虫的保守区域设计引物，以步骤（2）制备的PCR模板为模板，进行PCR；

（4）鉴定：将得到的PCR产物进行分析，从而确定线虫的种类。

2.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的三蒸水的量根据线虫大小而定，对于线形虫态的线虫虫体或虫卵，虫体短于1.5mm的线虫和虫卵三蒸水用量为6μl，虫体长于1.5mm的线虫三蒸水用量为12μl；对于膨大成球形、梨形等较大的非线形虫态的虫体，三蒸水用量为24μl。

3.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的三蒸水滴到PCR管内壁距管1cm的位置。

4.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的昆虫针为不锈钢昆虫针1号。

5.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的无菌昆虫针是指将昆虫针用无水酒精浸泡，然后在酒精灯火焰灼烧处理。

6.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的线虫裂解液为扎破的线虫虫体或虫卵得到的线虫裂解物和三蒸水的混合液。

7.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的保守区域为线粒体细胞色素氧化酶基因Ⅱ与LrRNA基因序列、内转录间隔区ITS序列、28S D2-D3扩增区序列和植物线虫细胞色素氧化酶基因Co Ⅰ区间序列中的一种或至少两种。

8.权利要求7所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：

所述的线粒体细胞色素氧化酶基因Ⅱ与LrRNA基因序列的引物如下：

上游引物#C2F3：5’-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3’

下游引物#1108：5’-TACCTTTGACCAATCACGCT-3’；

所述的内转录间隔区ITS序列的引物如下：

上游引物：5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’

下游引物：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’；

所述的28S D2-D3扩增区序列的引物如下：

上游引物：5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’

下游引物：5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’；

所述的植物线虫细胞色素氧化酶基因Co Ⅰ区间序列的引物如下：

上游引物：5’-CCTACTATGATTGGTGGTTTTGGTAATTG-3’

下游引物：5’-GTAGCAGCAGTAAAATAAGCACG-3’。

9.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的PCR反应的反应条件如下：94℃3min预变性；98℃变性10sec，52℃～55℃退火30sec，68℃延伸1min，35个循环；然后68℃再延伸10min。

10.权利要求1所述的用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的分析包括电泳分析、酶切分析以及测序分析。