[发明专利]用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法。

背景技术

植物寄生性线虫是世界范围内一类危害农林业生产的植物病原生物。到目前为止，大约有4100种植物线虫被描述，约占已描述的所有线虫种类的15%（Decraemer&Hunt，2006）。很多植物寄生线虫，如香蕉穿孔线虫（Radopholussimilis）、根结线虫（Meloidogyne spp.）和松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）等都是破坏性强的病原物，已经在很多粮食作物、观赏植物、蔬菜和林业树木上引起严重的危害，所以，很多国家将这些植物线虫列为检疫性有害生物（CABI&EPPO，1998）。传统的植物寄生线虫分类鉴定依赖形态特征，该方法需要丰富的分类鉴定经验，在种类水平上，一些近似种的准确鉴定更是比较复杂和困难。自从发明PCR技术，且秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）的基因组被完全测序后，分子诊断和鉴定方法已经被广泛应用于自由生活线虫、动物寄生线虫和植物寄生线虫，并为这些线虫的系统进化和分类研究提供了更丰富的信息（Floyd et al，2002；Powers，2004；Abebe et al，2011）。

在线虫分类上，核糖体RNA的排列和其间隔区以及线粒体基因组一些区间的序列特征常被用来作为鉴定的依据。根据序列区间的保守性，目前很多通用或者特异引物已经被设计出来用于线虫的鉴定或者系统进化分析。例如，用内转录间隔区（ITS）通用引物扩增的序列作为鉴定的标记，用28S rRNA基因D2-D3扩展区的通用引物扩增的序列分析线虫系统进化，此外，还有一些用于系统进化分析的线粒体细胞色素氧化酶基因的一些保守区间的特异引物（CI O或COII）（Powers&Harris，1993；Al-Banna et al，1997；Subbotin et al，2000；Powers，2004；Subbotin et al，2005a；De Ley et al，2005）。

植物寄生线虫的分子鉴定，需要先获得DNA模板。从自然界的土壤中、植物组织中通常一次能分离到多个种类混合的植物线虫，所以单条植物寄生线虫的DNA提取在分类学、系统进化和线虫检测鉴定等研究方面更有意义。单条植物线虫DNA的获得通常包括两个步骤，一是获得线虫裂解物，二是获得DNA粗提液。对于第一步，常用的方法就是挑取单条虫到载玻片上，在体视显微镜下切成2～3段，用移液器移到线虫裂解液（WLB）中，有的还会再把裂解物再进行反复冻融，使虫体组织充分裂解（Subbotin et al，2000；Wawyenberge et al，2000；Elbadri et al，2002；Bert et al，2008；Troccoli et al，2008；Huang et al，2010）；也可以把线虫虫体碎段或整条虫放入线虫简易裂解液中（如聚合酶的1倍缓冲液）（Subbotin et al，2005,2006），获得线虫裂解物。第二步就是将获得的线虫裂解液，用蛋白酶K进行消化约1h，然后再灭活蛋白酶，最终得到DNA模板粗提液，进行下一步PCR反应。此外，其它一些简单和快速获得线虫裂解液的方法也有报道，例如利用NaOH和Triton X-100直接裂解整条虫（Stantonet al，1998;Floyd et al，2002），或用SDS裂解液整条虫（Sakai，2010；Sakai etal，2011），然后直接用于PCR反应。总之，这些方法在PCR反应之前都需要加入试剂，所以相对耗时和操作复杂，且痕量的试剂残留可能会影响PCR的反应或后续的操作。而且由于植物寄生线虫虫体细小，成熟雌雄虫一般0.5-1.2mm，虫体直径为30-60μm，使得上述提及的单条线虫碎断转移过程使样本模板量损失很大或丢失，存在导致实验用PCR中DNA模板量不足的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，该方法即可实现简单、快速PCR反应鉴定，又能保证PCR目的片段的酶切及测序等后续试验操作不受影响。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种用单条线虫虫体或单个线虫虫卵鉴定植物寄生线虫的方法，为以单条线虫虫体或单个线虫虫卵为PCR模板，扩增得到保守序列，鉴定后确定线虫种类的方法。具体步骤如下：

（1）植物线虫样品的洗涤：在无菌的载玻片上滴无菌去离子水，用线虫挑针挑入单条线虫或单个虫卵；