[发明专利]中国水仙愈伤组织保存组培方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中国水仙组织培养方法，具体涉及一种中国水仙愈伤组织保存组培方法。

背景技术

中国水仙（Narcissus tazetta L. var. chinensis Roem）石蒜科水仙属多年生球根花卉，是我国传统十大名花之一，也是世界上冬季室内陈设的花卉之一，具有较高的观赏价值、经济价值和药用价值。目前，用于生产栽培的中国水仙主要有‘金盏银台’和‘玉玲珑’两个栽培品种，这主要是由于中国水仙采用侧球繁殖和侧芽繁殖等无性繁殖方法，繁殖周期长，繁殖速度慢，且中国水仙为三倍体，很难自然或人工杂交产生新品种，导致品种单一，品种稀少。此外，在栽培过程中易受到病毒的侵染而导致品质下降，品种退化。这些都严重影响中国水仙的商品生产和品种开发，不能满足市场需求。

Stone（1973年）首次成功地获得Narcissus tazetta cv.‘Grand Soleil d’Or的脱毒苗。随着组织培养技术的不断完善以及分子生物学的飞速发展，中国水仙的离体培养和基因工程研究越来越受到青睐。中国水仙离体培养主要采用小鳞茎发生途径获得再生植株，虽然该途径再生频率高，效果好，但是，在遗传转化研究中以小鳞茎作为受体材料的转化效率低，易发生褐变。因此，良好的受体系统对于中国水仙品种改良和开发是十分必要的。

愈伤组织是理想的受体材料，目前，利用带部分鳞片的鳞茎盘、带部分鳞茎盘的鳞片、花梗、未抽薹的花序、花药、子房、幼嫩叶片等外植体均可诱导出中国水仙愈伤组织，但是愈伤组织在继代培养或增殖过程中易褐化，繁殖系数不高，愈伤组织较难获得和保存。因此，迫切地需要寻求和建立一条中国水仙愈伤组织保存的有效途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在中国水仙愈伤组织难以继代和保存的问题，提供一种愈伤组织保存的组培方法，培养出良好的愈伤组织。　　　　　

本发明的目的是通过以下方法实现的：

本发明的中国水仙愈伤组织保存组培方法，包括材料选择、诱导培养、愈伤组织保存，其特征在于所述愈伤组织保存培养基为MN+1.0~3.0 mg/L 6-BA+0.5~1.5 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L NAA+30 g/L白糖＋6 g/L琼脂粉，pH5.8；其中，MN为基本培养基，1.0~3.0 mg/L 6-BA+0.5~1.5 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L NAA为激素组合；所述MN基本培养基配方如表1所示。

表1   MN基本培养基配方

                                                 

所述6-BA指6－苄氨基嘌吟；所述NAA指萘乙酸；所述2,4-D指2,4-苯氧乙酸。

本发明的中国水仙愈伤组织保存组培方法，包括以下步骤：

1、材料选择：取开花期且无病虫害的中国水仙子房，先用体积比为75%的酒精表面消毒，再用重量积比为0.1%升汞消毒5 min，最后用无菌水冲洗3次；

2、诱导培养：取步骤1消毒过的中国水仙子房，横切成5 mm厚度的薄片，接种到诱导培养基上；培养室温度为25 ℃～28 ℃，光照12 h/d，光照强度为1 200 lx～1 500 lx，培养60天；所述诱导培养基为MN+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L NAA＋30 g/L白糖＋6 g/L琼脂粉，pH5.8；

3、愈伤组织保存：按愈伤组织保存培养基的配方MN+1.0~3.0 mg/L 6-BA+0.5~1.5 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L NAA+30 g/L白糖＋6 g/L琼脂粉，配成pH值为5.8的愈伤组织保存培养基；将步骤2诱导培养的愈伤切成0.5 cm²的小块，接种到愈伤组织保存培养基中进行继代保存，在培养室温度为25℃～28℃，光照12 h/d，光照强度为1 200 lx～1 500 lx的条件下培养，每隔60天转接一次。

在中国水仙愈伤组织培养过程中，经常出现繁殖系数低，易褐化、生根和分化且难以保存等问题。为了探讨中国水仙愈伤组织保存的的方法，我们在MN基本培养基基础上，利用6-BA、2,4-D和NAA三种因素，通过正交设计，试验3种不同浓度的激素水平对中国水仙愈伤组织保存的影响。结果如表2所示。