[发明专利]一种重组淀粉脱支酶发酵生产工艺

说明书

技术领域

本发明属于酶发酵工程技术领域，本发明涉及一种重组淀粉脱支酶高效可溶性表达的发酵生产方法。

背景技术

淀粉脱支酶(E.C.3.2.1.41)是一类能够水解支链淀粉、α-极限糊精等分子中α-1，6葡萄糖苷键的淀粉水解酶。淀粉脱支酶通常和其它淀粉酶复配用于生产葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品。淀粉脱支酶可以切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前能够在最适温度和最适pH上同时实现与糖化酶进行较好配合的商品化淀粉脱支酶主要是美国杰能科公司的OptimaxL-1000。我国虽然对淀粉脱支酶进行了大量的研究，但是还没有实现该酶的工业化生产，还需要依赖进口。

近年来国内外学者把淀粉脱支酶的开发研究作为非常重要的研究主题。Bunzo Mikami等对来源于Klebsiella pneumoniae的淀粉脱支酶蛋白晶体结构进行解析，发现该酶具有GH13淀粉水解酶家族共有的(β/α)₈桶状结构。近年来国外学者从极端嗜热微生物中分离出具有可以耐受接近100℃高温的淀粉脱支酶，但是这些酶往往只有在pH 6.0以上才具有较高的活性。R Koch等从Fervidobacterium pennavorans中分离到最适pH在4.5到5.0，而且能够在70℃条件下具有较高稳定性的淀粉脱支酶。我国对淀粉脱支酶的研究虽晚于国外，但也有30多年的历史。早期工作主要围绕菌株的筛选。至上世纪90年代，我国市场上开始出售进口淀粉脱支酶，继而引发了对淀粉脱支酶在淀粉加工中的应用研究，并逐步推广到淀粉糖、酿造及其它发酵行业，带动了相关产业的技术提升。至2000年前后随着我国淀粉加工行业的快速发展，对淀粉脱支酶的需求激增，淀粉脱支酶生产菌株的开发逐渐升温。目前，我国科研人员先后在Bacillus、Thermotoga等微生物中筛选到一些性能优良的酶种，并开展了野生菌的诱变育种、酶的重组表达及发酵条件优化。唐宝英等人从土壤中分离出一株产淀粉脱支酶芽孢杆菌，通过诱变和产酶条件优化，酶活从1.6U/mL提高到8.8U/mL，该酶最适反应温度和pH分别为75℃和4.6，在55℃反应条件下，在pH4.0-8.0范围内活性稳定。张明炎等将来源于地衣芽孢杆菌的淀粉脱支酶编码基因克隆大肠杆菌中进行表达，摇瓶发酵产酶最高达到6.5U/mL。苏喆等实现了来源于Thermotoga maritima的淀粉脱支酶编码基因在枯草芽孢杆菌中的成功表达，该酶最适温度90℃，最适pH 6.0，发酵酶活可达89.1U/mL。但是这些菌株的产酶水平仍然较低，生产成本高。2005年云南师范大学杨元娟等将B.naganoensis淀粉脱支酶克隆到P.pastoris中表达，酶产量可达到350.8U/mL。我们以重组大肠杆菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌株，在工业级发酵培养基中连续流加甘油进行分批补料发酵，发酵后期通过添加Tween 80来促进活性蛋白聚集体解聚提高酶的分泌，发酵35小时，胞外酶活可达386U/mL(吴敬，陈晟，段绪果，陈坚：一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法.CN 201210035298.0)。除了少数报道外，大多数的表达水平仍然较低。

综上所述，大多数微生物来源的淀粉脱支酶属于胞外酶，由于野生菌产酶能力较低，研究者大多尝试采用大肠杆菌或枯草杆菌表达系统分泌重组酶。然而，重组淀粉脱支酶由于自身性质决定了其极易活性蛋白聚集体，导致可溶性表达水平很低。因此有必要对发酵工艺进行改进来进一步提高淀粉脱支酶的表达及分泌水平，继续降低其生产成本低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种通过增加淀粉脱支酶可溶性水平来提高淀粉脱支酶产量的方法，以解决现有发酵工艺中胞外酶活较低、生产成本高的问题。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种重组淀粉脱支酶发酵生产工艺，以重组大肠杆菌是pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)为生产菌种(一种通过促进活性蛋白聚集体解聚提高淀粉脱支酶产量的方法.CN 201210035298.0)，具体过程如下：

(1)种子制备：将-80℃甘油管保存的菌株接入种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200rpm/min，培养温度37℃，初始pH值7.10，培养时间8-10小时。