[发明专利]一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法

权利要求书

1.一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样4mL的比例加入预冷的提取缓冲液A，放入1-2g石英砂，研磨至匀浆；取3个10mL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个2mL的离心管分别编号为D、E、F；

(2)用6层无菌纱布过滤匀浆液，将磨碎组织放回研钵中，按每克样2mL补加缓冲液A 重新研磨并过滤，2次滤液合并；将滤液分装到A管中，500r/min离心10min，去除大片碎片组织；

(3) 将上清液转移至B管中，2600r/min离心2次，分别为15和10min，去除叶绿体等质体；

(4) 取上清液至C管中，10000 r/min离心15 min，弃上清，在沉淀中加入1 mL预冷的A液，用枪头轻轻吹起沉淀，混匀；1000r/min离心10min，将上清吸入D管中，加入1/500倍体积的100mg/mL DNaseI 和1/100倍体积的1mol/L MgCl₂；冰浴1h后加入1/25倍体积的0.5mol/L Na₂EDTA，静置10 min，终止DNaseI反应；

(5) 13200r/min离心15min，去上清，得到线粒体沉淀，再加ST液纯化1次，得到纯化的线粒体；

(6) D管沉淀中加1mL裂解液B悬浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2.5μL，50℃温育1 h，37℃再温育1h，期间间隔摇动；

(7) 取出离心管室温放置，待其冷却后，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例为25：24：1，充分混匀，放在摇床上摇动15min，10000 r/min离心10 min；

(8) 转上清液至E管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例为24：1，上下颠倒摇匀约10min，10000 r/min离心10 min；

(9) 将上清液转移至F管中，然后加入1/100体积10mg/mL的 RNaseA和1/500体积的1000U/μL的RNaseT₁37℃水浴1小时，去掉RNA；

(10) 加入等体积的氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例24：1，上下颠倒摇匀约10min，10000 r/min离心10 min；

(11) 取上清液至1.5mL的离心管中加入预冷的0. 1倍体积NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜；

(12) 4℃、13200r/min离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2~3次；

(13) 沉淀于空气中干燥后溶入少量水中，-20℃冷藏备用；

其中所用的试剂：

(1) 缓冲液A：1mol/L Tris-HCl 12.5mL、0.5mol/L Na₂EDTA 12.5mL、1.3 mol/L NaCl 15.743g，用灭菌双蒸水定容至250mL，高温高压灭菌，室温保存；使用前添加0.5g BSA、0.125g半胱氨酸、750μL β-巯基乙醇；

(2) ST液：蔗糖13.6916g，1mol/L Tris-HCl 5mL，0.5mol/L Na₂EDTA 5mL，用灭菌双蒸水定容至100mL，高温高压灭菌，室温保存；使用前添加0.1g BSA； 

(3)裂解液B：1mol/L Tris-HCl 2.5mL，0.5mol/L Na₂EDTA 4mL，10% SDS 5mL，用灭菌双蒸水定容至100mL，室温保存。