[发明专利]一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法。

背景技术

植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度离心、差速离心等方法；密度梯度离心得到的线粒体DNA虽纯度高， 但操作复杂、耗时， 而且对材料的需求量大，同时mtDNA产率低， 且长时间高速离心对离心机亦要求很高；利用密度梯度离心法提取线粒体DNA实验结果如图1所示，其主带不清晰，条带弥散，污染严重，而且过程繁琐、耗时长；普通的差速离心虽然操作简单， 但所提取的mtDNA纯度低、易降解， 以及核DNA、RNA和蛋白质等杂质污染严重，不能满足后续研究工作的需要；高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA具有操作简单，所提取的mtDNA具有结构完整、纯度和产率较高等优点, 能满足PCR分析、基因定位、克隆等分子操作的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法。

本发明的技术方案如下：

一种快速高效玉米线粒体DNA的提取及纯化方法，包括以下步骤：

(1) 将玉米外植体分装至预冷的研钵中，按每克样4mL的比例加入预冷的提取缓冲液A，放入1-2g石英砂，研磨至匀浆；取3个10mL的离心管分别编号为A、B、C，再取3个2mL的离心管分别编号为D、E、F。

(2)用6层无菌纱布过滤匀浆液，将磨碎组织放回研钵中，按每克样2mL补加缓冲液A 重新研磨并过滤，2次滤液合并。将滤液分装到A管中，500r/min离心10min，去除大片碎片组织；

(3) 将上清液转移至B管中，2600r/min离心2次，分别为15和10min，去除叶绿体等质体；

(4) 取上清液至C管中，10000 r/min离心15 min，弃上清，在沉淀中加入1 mL预冷的A液，用枪头轻轻吹起沉淀，混匀。1000r/min离心10min，将上清吸入D管中，加入1/500倍体积的100mg/mL DNaseI 和1/100倍体积的1mol/L MgCl₂。冰浴1h后加入1/25倍体积的0.5mol/L Na₂EDTA，静置10 min，终止DNaseI反应；

(5) 13200r/min离心15min，去上清，得到线粒体沉淀，再加ST液纯化1次，得到纯化的线粒体；

(6) D管沉淀中加1mL裂解液B悬浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2.5μL，50℃温育1 h，37℃再温育1h，期间间隔摇动；

(7) 取出离心管室温放置，待其冷却后，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例为25：24：1，充分混匀，放在摇床上摇动15min，10000 r/min离心10 min；

(8) 转上清液至E管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例为24：1，上下颠倒摇匀约10min，10000 r/min离心10 min；

(9) 将上清液转移至F管中，然后加入1/100体积10mg/mL的 RNaseA和1/500体积的1000U/μL的RNaseT₁，37℃水浴1小时，去掉RNA；

(10) 加入等体积的氯仿：异戊醇混合液，混合液混合体积比例24：1，上下颠倒摇匀约10min，10000 r/min离心10 min；

(11) 取上清液至1.5mL的离心管中加入预冷的0. 1倍体积NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃过夜；

(12) 4℃、13200r/min离心15min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤2~3次；

(13) 沉淀于空气中干燥后溶入少量水中，-20℃冷藏备用。

其中所用的试剂：

(1) 缓冲液A：1mol/L Tris-HCl 12.5mL、0.5mol/L Na₂EDTA 12.5mL、1.3 mol/L NaCl 15.743g，用灭菌双蒸水定容至250mL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加0.5g BSA、0.125g半胱氨酸、750μL β-巯基乙醇。

(2) ST液：蔗糖13.6916g，1mol/L Tris-HCl 5mL，0.5mol/L Na₂EDTA 5mL，用灭菌双蒸水定容至100mL，高温高压灭菌，室温保存。使用前添加0.1g BSA。