[发明专利]同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物及其扩增方法和用途

权利要求书

1.一种同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，其特征在于，实现两种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物，序列如下：

向日葵黑茎病菌的特异引物：LLF：TAG CAT TGT TAG CCG AGG

LLR：CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG

向日葵茎溃疡病菌的特异引物：DHF：CGA GAA ATC GTC CGT GAT

DHR：ATA CGG TCG GAC AGA CCA

所述LLF/LLR扩增片段为255bp，DHF/DHR扩增片段为394bp，特异引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的菌丝基因组DNA特异三重PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物，其特征在于，还包括检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的通用引物，序列如下：

ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G

ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

所述引物用于向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为560—600bp，作为提取和扩增过程的质量监测。

3.一种权利要求1所述的同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物的扩增方法，其特征在于，包括下述的扩增体系和扩增程序：

（1）扩增体系

建立20μL的扩增体系，包括10×Buffer 2.0μL，其中含终浓度为1.5mmol/L的MgCl₂；2.5mmol/L dNTPs为2.0μL；0.4μL Taq DNA聚合酶，浓度5U/μL；浓度为20μmol/L的引物ITS1/ITS4、LLF/LLR和DHF/DHR依次为1.0μL/1.0μL、0.8μL/0.8μL、0.6μL/0.6μL；DNA模板1.5μL；余量为双蒸水；

(2)反应程序

设立反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃复性20s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸7min。

4.如权利要求1所述同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物在检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌方面的应用。