[发明专利]一种利那洛肽的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，尤其涉及一种利那洛肽的纯化方法。

背景技术

便秘是一种常见病，从病因上可分为器质性和功能性两类。其中功能性便秘是由患者肠道蠕动异常而非肠道发生形态学病变所引起。功能性便秘部分患者为慢传输型便秘和肠易激综合征(IBS)型便秘。慢传输型便秘，是由于肠道收缩运动减弱，使粪便从盲肠到直肠的移动减慢，或由于左半结肠的不协调运动而引起。最常见于年轻女性，在青春期前后发生，其特征为排便次数减少（每周排便少于1次），少便意，粪质坚硬，因而排便困难；肛直肠指检时无粪便或触及坚硬粪便，而肛门外括约肌的缩肛和用力排便功能正常；全胃肠或结肠传输时间延长；缺乏出口梗阻型的证据，如气囊排出试验和肛门直肠测压正常。IBS属胃肠道功能紊乱性疾病。发病多与胃肠道动力异常或内脏感觉高敏感性有关，其症状常表现为腹痛、腹泻或便秘以及腹胀、内急等。

利那洛肽（Linaclotide），是美国食品与药物管理局（FDA）批准的一种具有新型作用机制的用于治疗慢传输型便秘和肠易激综合征(IBS)型便秘的口服药物。它是一种鸟苷酸环化酶-C激动剂，可激活肠上皮细胞顶端表面的GC-C受体，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸增多。净效应是氯和碳酸氢盐分泌进入肠腔增加，进而导致液体分泌增多以及大便通过加速。利那洛肽（150~300μg/d）可使每周的自发性排便数量增加，改善大便性状，减轻大便用力程度，以及便秘的严重程度。因此利那洛肽可作为治疗功能性便秘的一线用药之一，市场前景广阔。

利那洛肽，由14个氨基酸组成的多肽，分子式为C₅₉H₇₉N₁₅O₂₁S₆，分子量为1526.74。利那洛肽肽链中包含在Cys与Cys之间成环的三对二硫键（三对二硫键为1-6、2-10、5-13），其结构式如下：

目前，利那洛肽主要通过固相合成技术得到。由于利那洛肽有三对二硫键的存在，不管是采用固相偶联并固相定位氧化技术路线，还是采用固相偶联后液相氧化的技术路线进行合成，都会产生其它二硫键配对的杂质。但是只有利那洛肽三对二硫键的正确配对才能发挥疗效，因此通过纯化去除这些非正确配对杂质及其它杂质成为必然选择。由于利那洛肽粗品中二硫键非正确配对杂质数量众多且其化学性质与利那洛肽都非常相似，因此利那洛肽的分离纯化成为该药品制备工艺中的技术难点，尤其是大规模制备的利那洛肽的纯化已成为制约其产业化的瓶颈之一。至今未见有可规模化分离利那洛肽的纯化方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利那洛肽的纯化方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种利那洛肽的纯化方法，包括以下步骤：

步骤1：采用高效液相色谱法对利那洛肽粗肽进行纯化，所述高效液相色谱法以多孔石墨化碳为固定相，粗肽溶液上样后，以含有γ-环糊精的磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱，收集洗脱液；

步骤2：采用高效液相色谱法对步骤1所得洗脱液进行转盐，所述高效液相色谱法以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，步骤1所得洗脱液上样后，以冰醋酸水溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱，收集洗脱液，冻干即得。

本发明所述利那洛肽粗肽是指采用固相偶联并固相定位氧化技术路线或固相偶联后液相氧化的技术路线以及其它方法制得的、未经过精制处理的利那洛肽或者纯度不能满足药用的利那洛肽。

由于利那洛肽有三对二硫键的存在而具有较稳定的立体空间结构，该配对方式使利那洛肽与其它非正确配对杂质具有不同的立体空间结构和表面疏水性。本发明利用多孔石墨化碳固定相具有反相疏水作用及因碳原子形成类似于多环芳烃的大分子而分离几何异构体具有优势的特点，结合流动相中加入一定浓度的γ-环糊精作立体选择剂，采用高效液相色谱法进行利那洛肽的分离纯化，以多孔石墨化碳为固定相，粗肽溶液上样后，以含有γ-环糊精的磷酸盐缓冲溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相进行梯度洗脱，收集洗脱液。

本领域技术人员可以根据纯化利那洛肽粗肽的量，选择不同规格大小（柱子直径×长度）的色谱柱纯化如5cm×25cm规格色谱柱、10cm×25cm规格色谱柱或30cm×25cm规格色谱柱。