[发明专利]一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，间接ELISA法检测家兔血清抗苦马豆素抗体，包括以下步骤：

(1)包被：使用抗原包被缓冲液将苦马豆素人工抗原稀释到工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

(2)封闭：将孔内抗原液弃去，加入PBST洗涤液，每孔200μL，振荡30s后弃去孔内液体，拍干，PBST洗涤液的配制方法：十二水磷酸氢二钠2.9g，无水磷酸氢二钾0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，溶解于1000mL蒸馏水；重复洗涤3次后，每孔加入20g/L明胶溶液，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h进行封闭；

(3)添加待检血清及阳性、阴性血清：弃去孔内明胶溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的待检血清、阳性血清和阴性血清，并以PBS溶液为空白对照，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；

(4)添加酶标二抗：弃去孔内血清，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的HRP-羊抗兔酶标抗体，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；

(5)添加底物溶液：弃去孔内溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL底物溶液，底物使用四甲基联苯胺，即TMB，配置方法为：底物显色A液：无水醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，用蒸馏水定容于500mL；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，0.15g TMB，3mL DMSO，用蒸馏水定容于500mL，使用时AB液等量混合，将酶标板置于37℃培养箱内培养30min；

(6)终止：将酶标板拿出培养箱后，立即向每孔加入2mol/LH₂SO₄溶液终止反应，立即使用酶标仪测定OD₄₅₀值，以待检血清OD₄₅₀值(P)和阴性血清OD₄₅₀值(N)的比值(P/N)≥2.1判定样品为阳性。

2.根据权利要求1所述的家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，包被抗原选择为SW-OVA，工作浓度为10μg/mL，抗原包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，配置方法为2.93g碳酸氢钠和1.95g碳酸钠溶解于1000mL蒸馏水。

3.根据权利要求1所述的家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，血清稀释度为1∶200，稀释液选用包被缓冲液。

4.根据权利要求1所述的家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，酶标二抗稀释度为1∶1500，稀释液选用包被缓冲液。

5.根据权利要求1所述的家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，底物更换为四甲基联苯胺二盐酸，即TMB·2Hcl，在底物显色B液中弃去DMSO。

6.一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括已包被完全的96孔酶标板(包被抗原为10μg/mL的SW-OVA)、阳性血清(抗体效价2¹²～2¹⁴)、阴性血清、HRP-羊抗兔酶标抗体PBS溶液、PBST洗涤液、底物显色A液、底物显色B液、终止液。