[发明专利]一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，涉及一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法及试剂盒。

背景技术

疯草(locoweed)是豆科(Leguminosae)棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalas)有毒植物的统称，由此而引起的中毒病称为疯草中毒(Locosim)或疯草病(Locodisease)。我国疯草主要分布于内蒙古、宁夏、甘肃、陕西、青海、新疆、西藏等省区。分布面积已超过1100万hm²，约占全国草场总面积的2.8％，占西部草场面积的3.3％，且每年以3.5％的速度蔓延。疯草已成为我国西南、西北牧区危害草原畜牧业可持续发展的主要毒草。苦马豆素(Swainsonine，SW)是疯草的主要毒性成分之一，对疯草中毒病的发病机理和防治有重要意义。

新疆是我国五大草原畜牧业省份之一，天然草地总面积为5596.16×10⁴hm²，其中可利用面积4800.68×10⁴hm²，是已垦农地的10.4倍，林地的18倍。然而，由于“超载过牧”等原因，现已引起疯草等有毒植物的广泛蔓延，优质牧草严重退化，造成大量放牧家畜中毒，其中阿克苏地区每年中毒家畜在5％～10％，严重时可达50％，不利于新疆畜牧业的可持续发展。

疯草属于豆科植物，除含有疯草毒素外，还含有丰富的营养物质。其中黄花棘豆的粗蛋白含量高达20％，超过“饲料之王”的苜蓿，小花棘豆粗蛋白、钙、磷含量及必需氨基酸组成接近于优质苜蓿，将甘肃棘豆的添加量控制在10％以内饲喂家兔，家兔的体质量增加量与棘豆饲喂量成正比，说明疯草有较好的利用前景。

目前多采用免疫学方法使动物获得抗苦马豆素抗体，以期在动物采食疯草时获得保护。其免疫效果的确定有赖于抗体的准确检测，ELISA法因具有快速、敏感、准确等优点而得到广泛应用。本课题组以家兔为试验动物，通过制备苦马豆素人工抗原，筛选包被抗原，制备阳性血清和阴性血清，制备HRP-羊抗兔酶标抗体，建立测定方法，从而得到检测家兔血清抗苦马豆素抗体的ELISA检测试剂盒，为家兔安全利用疯草提供基础。而到目前为止，并未有家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测试剂盒的研究报道和专利申请。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种设备简单，操作方便的家兔血清抗苦马豆素抗体检测方法及试剂盒。通过该方法的实施，达到对家兔免疫效果的快速、敏感、准确的判断，操作方法简单易行，适用于科研院所和基层畜牧系统。

具体技术方案为：

一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，间接ELISA法检测家兔血清抗苦马豆素抗体，包括以下步骤：

(1)包被：使用抗原包被缓冲液将苦马豆素人工抗原稀释到工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

(2)封闭：将孔内抗原液弃去，加入PBST洗涤液，每孔200μL，振荡30s后弃去孔内液体，拍干。PBST洗涤液的配制方法：十二水磷酸氢二钠2.9g，无水磷酸氢二钾0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温-200.5mL，溶解于1000mL蒸馏水；重复洗涤3次后，每孔加入20g/L明胶溶液，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h进行封闭；

(3)添加待检血清及阳性、阴性血清：弃去孔内明胶溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的待检血清、阳性血清和阴性血清，并以PBS溶液为空白对照，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；

(4)添加酶标二抗：弃去孔内血清，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的HRP-羊抗兔酶标抗体，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；

(5)添加底物溶液：弃去孔内溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL底物溶液，底物使用四甲基联苯胺，即TMB，配置方法为：底物显色A液：无水醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，用蒸馏水定容于500mL；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，0.15g TMB，3mL DMSO，用蒸馏水定容于500mL，使用时AB液等量混合，将酶标板置于37℃培养箱内培养30min；