[发明专利]一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒

权利要求书

1.一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管(1)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、三个标准品管（5）、三个阳性对照品管（6）和盒体（7）组成，其中定量RT-PCR反应液管（1）包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物管（2）包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管（3）包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管（5）分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管（6）分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品；阴性对照管(4)包含高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，三个阳性对照品分别为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品；

检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：

上游引物NVGI-F: 5’- ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’

下游引物NVGI-R：5’- TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’

特异性探针NVGI-P: 5’-FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’

上游引物NVGII-F: 5’-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’

下游引物NVGII-R: 5’-CGACGCCATCTTCATTCACA-3’

特异性探针NVGII-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA--BHQ1-3’

上游引物SV-F: 5’- CAGGCTCTCGCCACCTACA-3’

下游引物SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’

特异性探针SV-P: 5’-ROX- CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’

所述的三种标准品基因序列如下：

GI型诺如病毒病毒标准品序列为：

ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT   CAAAGCGCTG   ATGGCGCAA

GII型诺如病毒病毒标准品序列为：

ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA   TGACGCCACT    CCATCTAA

札如病毒标准品序列为：

AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT   GGAGGGCAAT   GGCTCCAACT   CAGA 。

2.根据权利要求1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，引物探针混合液管（3）为棕色管。

3.根据权利1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，其特异性的荧光探针5’端为包括FAM、HEX、ROX、CY5或CY3的荧光报告基团，3’端为包括BHQ1、BHQ2或BHQ3的荧光淬灭基团。

4.根据权利1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，其阴性对照为高温高压灭菌的DEPC焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品。

5. 根据权利1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃。

6.根据权利要求1所述的一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒在检测GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒中的应用。