[发明专利]一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

  本发明属生物技术领域，涉及一种检测荧光定量RT-PCR试剂盒，具体涉及一种一步法检测人杯状病毒的三重实时荧光定量RT-PCR试剂盒。 

背景技术

    人杯状病毒（Human calicivirus, HuCVs）是引起儿童和成人非菌性急性腹泻的主要病原之一，仅次于轮状病毒。它传染性强，在世界各地广泛传播，尤其是对婴幼儿健康影响较大。最早发现的人杯状病毒是由美国学者Kapikin于1972年采用免疫电镜方法从俄亥俄州诺瓦克地区一所学校暴发的胃肠炎病人粪便标本中检出，并以发现地将其命名为诺瓦克病毒。此后，人杯状病毒在世界各地不断被发现，根据病毒形态结构、抗原特性、宿主范围和所致疾病的临床症状，以及病毒基因组序列和和遗传进化分析的结果进行病毒分类，2002年8月第八次ICTV确定人杯状病毒包括两个属：诺如病毒属(Norovirus，NV)和札如病毒属(sapovirus，SV)。 

诺如病毒毒株间具有很大核苷酸序列多样性，依据基因结构ORFl和ORF2之间的差异，诺如病毒分为5个基因组（GI-GV），其中GI(以nonvalk-1ike virus为代表)和GII(以Snow Mountain virus为代表)是感染人类的两个最常见的基因组。 

札如病毒即札幌病毒，为单股正链RNA病毒，其原型毒株最早为1977年日本学者Chiba等从札幌某托儿所一系列的腹泻爆发研究中所证实。此类病毒所致疾病主要与人和动物的胃肠炎有关，不同年龄段人群都可感染，引起腹泻，主要以婴幼儿最为易感。札如病毒主要经粪-口途径传播，在有些地区，札如病毒逐渐成为仅次于诺如病毒引起病毒性腹泻的主要病因。 

由于人杯状病毒不能进行细胞和组织培养，其检测方法的发展受到了很大限制。传统的杯状病毒检测方法主要有电镜、放射免疫试验、酶免疫试验等，但这些方法均不够敏感。随着基因组测序技术的进展，据此建立的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人杯状病毒，使得检测灵敏度大大提高。目前的方法学检测中，RT-PCR方法已成为检测人杯状病毒最敏感、也是应用最广泛的方法。 

   实时荧光定量PCR技术具有全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。但是单管实时荧光定量RT-PCR检测一种病原，不仅耗时耗力，也浪费试剂耗材，因而建立可同时检测多种病原的多重实时荧光定量RT-PCR诊断方法与诊断试剂尤其重要。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。其中定量RT-PCR反应液管包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液管包含三种病毒的特异性引物和相应的三种不同荧光标记的探针。 

阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒的阳性质粒样品。引物探针混合液管需为棕色管。 

    三重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下： 

上游引物NVGI-F: 5’- ATGTTCCGBTGGATGCGSTT-3’

下游引物NVGI-R：5’- TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’

特异性探针NVGI-P: 5’-FAM-ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC-BHQ1-3’

上游引物NVGII-F: 5’-GARCCNATGTTCAGRTGGATG-3’

下游引物NVGII-R: 5’-CGACGCCATCTTCATTCACA-3’

特异性探针NVGII-P: 5’- HEX-TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA--BHQ1-3’

上游引物SV-F: 5’- CAGGCTCTCGCCACCTACA-3’

下游引物SV-R: 5- TGCCCTCCATCTCAAACACTATT-3’

特异性探针SV-P: 5’-ROX- CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC-BHQ2-3’