[发明专利]一种检测MTHFR基因多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及焦磷酸测序技术在基因多态性检测方面的应用，具体涉及一种检测MTHFR基因多态性的方法，还涉及一种MTHFR基因的扩增引物、检测MTHFR基因多态性的测序引物及含有它们的试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。目前，SNP成为第三代遗传标志，其在疾病的早期风险性评估、早期诊断、预防和治疗等各方面具有重要功能和应用价值。

MTHFR（亚甲基四氧叶酸还原酶）基因可编码亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白，该酶的主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接地为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个比较低的水平。MTHFR基因存在多态性，可影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和热稳定性。MTHFR基因677位点的多态性可引起该酶的热不稳定性增加，酶活性下降，导致血液中同型半胱氨酸浓度升高。

目前国内外有关SNP检测的技术研究已经非常广泛，用于SNP检测的主要方法如下：

（1）SSCP技术

即单链构象多态性检测技术，是将经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并保证在单链状态下，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA，可以因其顺序或单个碱基差异，所形成的空间构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异。

（2）RFLP技术

即限制性片段长度多态性分析技术，该方法的原理是碱基的变异可导致已有酶切位点的消失或新的酶切位点的出现，从而引起不同个体在用同一限制性内切酶酶切时，DNA片段长度出现差异。

（3）TaqMan探针技术

TaqMan探针技术是在常规PCR反应体系中加入一个荧光标记探针，该探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，若探针可以与模板完整退火，那么Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

（4）基因芯片技术

基因芯片技术的原理是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列。

（5）Sanger测序技术

Sanger测序技术原理是利用DNA聚合酶能够以单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链。该酶能够用2’，3’——双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’末端，从而终止其延伸反应。在含有模板、引物，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP反应管中，DNA聚合酶合成出一系列以ddNTP为3’末端的不同长度的新链，经电泳和放射自显影后，能迅速地读出DNA序列。其检测过程包括质粒提取或PCR产物纯化、模板质量鉴定、模板定量以及DNA测序反应。

（6）焦磷酸测序技术

随着科技的发展，焦磷酸测序技术的应用为SNP的研究和临床检测提供了新的技术平台。焦磷酸测序技术是一项全新的DNA测序技术，该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。该技术的原理是：

第1步：测序引物与单链PCR产物模板结合，然后加入酶混合物（包括4种酶，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）和底物混合物（包括腺苷-5'-磷酰硫酸（APS）和荧光素）；

第2步：向反应体系中加入dNTPs（每次只添加一种dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP或dGTP），如果该dNTP刚好能与模板碱基配对，则其会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出等分子量的焦磷酸（PPi）。

第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD摄像机即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低与合成的核苷酸碱基数成正比。