[发明专利]一种最适温度提高的脂肪酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶突变体，特别是一种最适温度提高的脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是工业脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，最适温度为40°C，限制了其应用范围，降低了催化效率。

蛋白质理性设计是改变酶性质的有利工具，它建立在人们对酶结构—功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。进年来，随着结构生物学、分子动力学模拟、蛋白质折叠机制等领域的发展，酶的理性设计已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面（Bornscheuer U T et al.Trends Biotechnol,2002,20(10):433-437。

发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al.J Mol Catal B:Enzym,2009,57:304-311），应用研究表明该酶在烘焙食品工业、皮革脱脂以及造纸废水处理中都具有非常广阔的应用前景。本发明以华根霉脂肪酶基因为模板，利用蛋白质理性设计技术获得了最适温度提高的脂肪酶突变体，提高了该酶的应用范围与催化效率。

酶的最适温度可以通过将酶在相同的标准条件下测定催化活力来测定，酶催化活力最高时的反应温度即为该酶的最适温度。

定义：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

脂肪酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。Asp310Val，表示位置310的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp替换成Val。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种最适温度提高的脂肪酶突变体，在GenBankXXXXX公布的脂肪酶脂肪酶基因序列第310的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp突变为Val。

上述突变体的获得方法为以GenBank EF405962公布的脂肪酶脂肪酶基因序列为出发基因,将其第310位的氨基酸由Asp替换成Val。

产所述脂肪酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求的保护范围。

所述产脂肪酶突变体的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述脂肪酶突变体基因；

2）将步骤1）获得的脂肪酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；

3）将步骤2）获得的重组表达载体转化毕赤酵母GS115得到基因工程菌。

所述表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα或pPICZ。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产上述脂肪酶突变体的方法，以产脂肪酶突变体基因工程菌为生产菌株，按10％（V/V）接种量接入25mL BMGY培养基中，30℃振荡培养16～20h至OD₆₀₀为2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD₆₀₀为1，每隔24h添加0.5%的甲醇诱导表达，培养3-4d后，收集发酵上清液；将发酵上清液经过10KD超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。