[发明专利]一种蛋白质泛素化快速检测载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种泛素化检测载体，特别是一种可用于泛素化快速检测的载体，属于分子生物学领域。

背景技术

泛素（ubiquitin,ub）一种由76个氨基酸残基组成的低分子量的蛋白质，其因广泛存在于真核细胞及组织中而得名。泛素化（ubiquitination）是一种重要的翻译后修饰作用，是指一个或多个泛素分子在一系列酶的催化作用下与其他蛋白质共价结合的过程。转录调节、蛋白质磷酸化及泛素化调节是调控细胞内蛋白质表达水平及功能的重要途径。泛素化调控涉及到泛素-蛋白酶降解途径（ubiquitin-protease degradation），即被泛素修饰的蛋白质受到蛋白酶的降解。但是也有些泛素化与蛋白质的稳定性有关。因此，如何快捷、准确的获知蛋白质的泛素化及泛素化水平具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种用于快捷简便地检测蛋白质泛素化及其亚细胞定位的载体。该载体具有两套启动子-终止子序列（TEF启动子-ADH1终止子和GPD启动子-CYC1终止子）及融合基因GN-UBI3和MCS-GC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用者只需将待研究蛋白质的编码基因去掉终止密码子后克隆至MCS即可实现共表达载体的构建。

关于pYL16使用范围，由于pYL16的选择性标记为URA3，理论上，任何URA3缺陷型酵母菌株均可作为pYL16的表达宿主。本发明使用CEN.PK2-1D(MAtα ura3-52;trp1-289;leu2-3,112;his3Δ1;MAL2-8^C;SUC2；购自EUROSCARF，acc.no.30000B）作为宿主细胞来验证pYL16的可靠性。

融合基因GN-UBI3及MCS-GC分别被插入至基础质粒pY26的GPD启动子-CYC1终止子之间和TEF启动子-ADH1终止子之间。

在GN-UBI3的上下游分别引入限制性酶切位点BamH I、Xho I，通过插入消除了pY26多克隆位点，其中包括限制性酶切位点Xma I、Ava I、Sma I、Pst I、EcoR I、Hind III、Cla I；在MCS-GC的上下游分别引入限制性酶切位点Not I、Bgl II，且通过插入质粒引入了新的MCS，其中包括的限制性酶切位点为Not I、EcoR I、Sal I、Sma I、Ava I、Xma I、Sac II。

增强型绿色荧光蛋白EGFP的拆分位点为158-159位氨基酸之间，即GN为EGFP的1-158位氨基酸组成的片段；GC为EGFP的159-238位氨基酸组成的片段。

GN-linker-UBI3及MCS-liner-GC（本研究一般简写为GN-UBI3及MCS-GC）中的linker结构由17个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种共表达质粒的构建方法，以该质粒作为基础质粒可快速便捷地构建蛋白质泛素化研究中的共表达系统。包括：（1）选择EGFP的拆分位点，以将其拆分为GN和GC两个片段，拆分位点为158-159位氨基酸之间；（2）选择linker结构，以为GN、GC重新组装成完整的EGFP提供足够的空间；（3）通过融合PCR的方法，构建融合基因GN-UBI3及MCS-GC，同时在上下游引入相应的限制性酶切位点；（4）通过BamH I/Xho I将GN-UBI3插入至基础质粒pY26的GPD启动子-CYC1终止子之间，同时消除此处的多克隆位点，包括限制性酶切位点Xma I、Ava I、Sma I、Pst I、EcoR I、Hind III、Cla I，得到重组质粒pY26-GN-UBI3；（5）通过Not I/Bgl II将MCS-GC插入至重组质粒pY26-GN-UBI3的TEF启动子-ADH1终止子之间，引入的MCS包括限制性酶切位点Not I、EcoR I、Sal I、Sma I、Ava I、Xma I、Sac II，最终得到目的质粒pYL16。