[发明专利]转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法

说明书

技术领域

 本发明提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法。

背景技术

随着全球转基因产品的日益增多，以及越来越多的转基因作物特异品系获得商品化生产，检测特异性品系已成为国际上转基因成分检测的发展趋势。目前，检测转基因特异品系的方法主要有普通PCR方法和实时荧光PCR方法。普通PCR方法，具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染，质控复杂，假阳性、假阴性比例偏高等缺点。实时荧光PCR方法则具有成本昂贵、技术要求高、需要大型的仪器设备等缺点，均已经不能满足食品中转基因成分的日常监管和食品生产行业内部质控的需求。因此，目前急需建立能够普遍适用于检验检疫一线的基层实验室的快速、简便、准确的转基因品系检测方法。

环介导等温扩增技术 ( loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4~6 条特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件(63 ℃左右) 保温30－60分钟，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳白色沉淀，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定结果。LAMP技术具有简便、高效、特异、快速等优点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，在灵敏度、特异性能媲美甚至优于普通PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。LAMP技术在食源性致病微生物的快速检测中已得到广泛应用，但在转基因产品检测上的应用研究很少。目前，国内采用LAMP技术对转基因成分的研究尚处于起步阶段，且主要应用于启动子、外源基因的检测，极少应用于转基因品系的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物及方法。

本发明首先提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测引物，所述LAMP检测引物如下：

外引物F3：5'-GAC ACA TCT CAT TGC ACT GA-3'

外引物B3：5'-CGA GTT CTG TTA GGT CCT CTA-3' 

内引物FIP：5'-TGG CGT AAT AGC GAA GAG GCG TGA GTT ATT TAT CAG CCA AGC-3'

内引物BIP：5'-GGA TGT GCT GCA AGG CGA TTT ACA ACG TCG TGA CTG G-3'

环引物LF：5'-CCG CAC CGA CAT AAG AAG A-3'

环引物LB：5'-AAG TTG GGT AAC GCC AGG-3'。

本发明还提供了一种转基因大豆A2704-12的LAMP检测方法，利用所述的LAMP检测引物，以Bst DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。

  环介导等温扩增的反应条件为：63℃温育1h，80℃保温5min；反应体系为：10 ×ThermoPol缓冲液2.5μL，10 μmol/L外引物F3 0.5μL，10 μmol/L外引物B3 0.5μL，40 μmol/L环引物LF 0.5μL，40 μmol/L环引物LB 0.5μL，40 μmol/L内引物FIP 1.0μL，40 μmol/L内引物BIP 1.0μL，10 mmol/L dNTPs 4.0μL，5 mol/L甜菜碱 6.0μL，150 mmol/L硫酸镁1.0μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶大片段1.0μL，100 ng/μL DNA模板2.0μL，ddH₂O 4.5μL。

本发明建立的LAMP检测方法的优点：①快速、高效：扩增约1 h即可完成，且产率高；②简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，通过观察浊度或加入显色液观察颜色变化就可判定检测结果，不需要特殊的、昂贵的仪器设备，操作非常简便；③高特异性：采用六个区段、四条或六条引物，扩增特异性高，保证了结果的准确性。