[发明专利]一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉所产生的胞外脂肪酶，以及脂肪酶的生产方法和应用。 

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3），即三酰基甘油酰基水解酶，能将甘油三酯催化水解为游离脂肪酸和二酰甘油、一酰甘油或甘油。此外，还可以催化一系列反应如酯化反应、酯交换反应、酸解、醇解、氨解等反应（徐玉丽等，微生物学报，2011，51(2)：233-240）。脂肪酶广泛存在于动物、植物、微生物中（王自社等，安徽农业科学，2011，39(7)：3798-3800），而微生物脂肪酶比动、植物脂肪酶具备更好的稳定性、更强的耐有机溶剂性、更广的底物特异性（刘海洲等，食品研究与开发，2009，30(1)：141-143），胞外脂肪酶被证实为具有高产、高效和高选择的生物催化剂，在制药、食品、化妆品和洗涤剂等工业得到广泛应用（Pandey A，Appl.Biochem.，1999，29：119-131）。 

随着人们对微生物脂肪酶认识的不断加深，应用范围正在不断拓宽，对酶的耐受性（极端温度、压力）要求也越来越高，许多工业用脂肪酶不能够满足苛刻的工艺温度、pH和有机溶剂而限制了其使用（董明奇等，四川大学学报（自然科学版），2008，45（4）：985-990）。因此，发掘具有特殊酶学性质的产脂肪酶菌株具有很大的工业应用价值，而这些菌株一般都来源于特殊的生长环境。 

关于黑曲霉产脂肪酶，国内只有零星的菌种选育（任丽虹等，工业微生物，26（1）：23~26，1996）和脂肪酶的分离纯化（舒正玉等，生物工程学报，23（1）：96~100，2007）报道，而且目前的脂肪酶大部分为碱性或中性脂肪酶，限制了工业应用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉菌株产生的脂肪酶及其生产方法和应用，利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过盐析、透析和层析分离制备电泳纯脂肪酶。 

本发明的目的可以通过以下技术方案实现： 

本发明从西藏奶渣中分离出一株脂肪酶产生菌，编号为0512。根据菌株的形态特征和18S rRNA分子鉴定，确定0512菌株为黑曲霉（Aspergillus niger），并进一步将该菌株编号为AN0512。本发明菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2012年11月19日，保藏号是CGMCC No.6835。 

一种利用上述黑曲霉菌株生产脂肪酶的方法，包括如下步骤： 

将处于对数生长期的黑曲霉（Aspergillus niger）AN0512菌悬液接种于液体发酵培养基，接种量为1.4%-1.6%v/v，进行发酵培养，将得到的发酵液离心或过滤去除菌体即得粗酶液；液体发酵培养基主要包括w/w：橄榄油0.8%-1.2%，酵母提取物0.5%-2%，pH 5.0-7.0，以及磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钾0.05%，余量为水。 

优选地，所述粗酶液还经如下分离纯化步骤：粗酶液经百分饱和浓度为 50-70%w/v的硫酸铵沉淀，离心取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心去沉淀，将清液透析除盐后，采用阴离子层析、分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶。 

优选地，所述发酵培养条件为：搅拌转速150-250r/m，培养温度27-29℃，发酵时间90-100h。 

上述所得粗酶液用于催化酯交换或酯化反应，反应温度为25-60℃，pH为4.0-10.0。优选地，所述粗酶液催化反应的温度为27-35℃，pH为6.0-8.0。 

上述所得电泳纯脂肪酶用于催化酯交换或酯化反应的温度为20-60℃，反应的pH为3.0-8.0。优选地，所述脂肪酶催化反应的温度为45-55℃，pH为4.0-6.0。进一步优选地，所述脂肪酶的催化反应温度为50℃，pH为5.0。 

在所述酯交换或酯化反应中添加Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁醇以促进脂肪酶的催化反应。而加入Fe²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、EDTA、洗涤剂则可以抑制所述脂肪酶的催化反应。 

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：