[发明专利]一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐酸性淀粉酶突变体及其制备方法。

背景技术

酸性淀粉酶是在酸性条件下能水解淀粉的酶类，可应用于酸性条件下淀粉原料的加工，显著的耐酸性使其具有很大的应用潜力和开发前景，广泛应用于青贮饲料、发酵饮料、废液的处理等多种领域。酸性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选和突变获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。突变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。

发明内容

本发明提供了一种耐酸性淀粉酶突变体，其特征在于，淀粉酶催化区域内组氨酸替换为天冬氨酸。

所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸得到的突变体。

所述SEQ ID NO.1已提交NCBI，序列号NO:JQ768415。

本发明还提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，是将催化区域内组氨酸突变成天冬氨酸。

具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，分别将第222位、第275位、第293位和第310位的组氨酸突变成天冬氨酸。

所述制备所述淀粉酶突变的方法，具体步骤如下：

1）根据枯草芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；

2）利用Swiss-model软件对源自枯草芽孢杆菌淀粉酶（SEQ ID NO.1）进行模拟，获得淀粉酶空间结构；

3）通过对淀粉酶空间结构进行分析，确定要突变的组氨酸位点；

4）设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将组氨酸位点突变为天冬氨酸，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；

5）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。

表1淀粉酶突变引物序列

本发明提供的淀粉酶突变体耐酸性强，针对单突变而言，在pH4.5条件下，淀粉酶的催化效率（k_cat）由2.1×10²s^-1增长为6.0×10²s^-1，增加了3倍；复合突变后，催化效率（k_cat）增长为10.7×10²s^-1，增加了5倍。同时，复合突变后，淀粉酶最适反应pH由7.0降低为4.5，耐酸性显著提高。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该耐酸性淀粉酶突变体应用于食品、医药、化工等领域，可以在强耐酸性环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pAmyQ的质粒图谱。

图2：淀粉酶3D空间结构。

图3：突变前后，淀粉酶最适反应pH变化趋势。

具体实施方式

实施例1：淀粉酶耐酸性定点突变分析与方法

通过对淀粉酶3D空间结构（图2）进行分析，确定催化区域内对酶的耐酸性不稳定的组氨酸残基（His222,His275,His293,His310）。

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成后，克隆到质粒pET-20b(+)中，构建重组质粒pAmyQ。

针对不同His位点的定点突变，设计相对应的定点突变引物（表1）。利用定点突变引物，淀粉酶进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pAmyQ进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得耐酸性突变后的重组淀粉酶(His222位点突变成Asp后，酶的活性失活)。

实施例2：淀粉酶耐酸性定点突变分析与方法

DNS法测定碱性淀粉酶酶活