[发明专利]一种高催化效率碱性淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高催化效率淀粉酶突变体及其制备方法。

背景技术

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是一种降解淀粉的重要的工业用酶，主要应用在食品、纺织、医药、洗涤剂等领域。耐氧化性淀粉酶可用于纺织品退浆、洗涤剂添加剂以及以淀粉作粘结剂的粘度调节剂等。Horikoshi在1971年首先报道了产自嗜碱菌A-40-2的碱性淀粉酶。2007年Saxena等人筛选到一株可以产碱性淀粉酶的菌株。2010年Pancha等（Pancha I,Jain D,ShrivastavA,Mishra S,Shethia B,Mishra S,VP M,Jha B.A thermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp.isolated fromCSMCRI salt farm.International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(2):288-291.）筛选出一株产耐温淀粉酶菌株。目前，国内的前处理酶制剂市场基本被丹麦诺维信公司和美国杰能科公司所垄断。诺维信公司介绍了一种淀粉酶，有较宽的pH及温度范围。具有耐化学氧化性的淀粉酶主要应用于洗涤剂添加剂和纺织退浆一浴法等工业中。但耐氧化性淀粉酶的工业化生产并没有报道。耐氧化性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选、诱变和酶分子改造获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。诱变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。酶分子改造目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，达到耐氧化性的目的。

发明内容

本发明提供了一种高催化效率淀粉酶突变体，是淀粉酶的N端区域与短肽通过PT-linker连接得到的突变体。

所述短肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述PT-linker序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还是提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，其技术方案如下：

1）据短肽序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pET-22b(+)-P；

2）根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）的淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成；

3）针对已分析序列设计引物，将全合成的淀粉酶序列克隆到重组质粒pET-22b(+)-P中，构建含有短肽和淀粉酶片段的重组质粒pAAQ-P，将短肽融合到碱性淀粉酶的N-端，获得含有突变淀粉酶序列与短肽序列融合状态的重组载体；

4）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得突变株。

5）测定突变株表达淀粉酶的催化效率。

本发明提供的淀粉酶突变体催化效率高，在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶比酶活比对照（突变前）例的比酶活提高4.1倍；催化效率比对照（突变前）例的催化效率提高3.5倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该高催化效率淀粉酶突变体应用于纺织退浆、洗涤剂添加等领域，可以在高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：pAAQ-P的质粒图谱。

图2：淀粉酶3D空间结构。

具体实施方式

实施例1：淀粉酶高催化效率提高突变分析与方法

通过对淀粉酶3D空间结构（图2）进行分析，确定区域A（催化区域）、区域B、区域C。同时，对催化区域（催化区域）进行分析发现3个活性位点（Asp238,Glu268,Asp330）。根据淀粉酶的氨基酸序列及结构相关性，选用短肽与碱性淀粉酶序列进行融合表达，提高其催化效率。