[发明专利]两个对虾新型表达载体构建方法

权利要求书

1.两个对虾新型表达载体构建方法，其特征是两个对虾新型表达载体是双链环状DNA，是通过改造真核表达载体PCDNA3.1获得的，方法如下：

1）引物设计与合成：

参照GenBanK中WSSV基因组序列合成WSSV病毒早期基因启动子IE（-94/+52）和IE（-945/+52）引物，见表1：

表1引物

Tab,1Primer

引物由华大基因生物工程有限公司合成；

2）IE（-94/+52）和IE（-945/+52）的扩增：

PCR反应采用25.0μL体系：WSSV DNA模板2μL，2xPCR mix 12.5μL，上下游引物(25μmol/L)各1μL，超纯水8.5μL；IE（-94/+52）PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃35sec，35个循环；72℃10min；IE（-945/+52）PCR反应程序：94℃5min；94℃30sec，51℃30sec，72℃35sec，35个循环；72℃10min；

3)目的片段IE（-94/+52）和IE（-945/+52）的克隆与转化：

PCR产物按凝胶回收试剂盒说明进行目的片段回收后，与PEASY-T1克隆载体连接：PCR产物4μL，PEASY-T1克隆载体1μL,轻轻混合后，室温放置10min，反应结束后将反应管置冰上，加连接产物于50μL Trans1-T1化学感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30sec，立即放冰上2min；反应物加入500μL LB培养液，37℃震荡培养1h；取培养液200μL菌液涂布LA平板，37℃培养12小时；

4)重组质粒PEASY-T1-IE（-94/+52）、PEASY-T1-IE（-945/+52）的鉴定：

挑取上述LA平板上的单一细菌菌落，接种至500μLB培养液，37℃震荡培养3h，取1μL菌液进行PCR鉴定，方法见PEASY-T1克隆载体试剂盒说明；

5)序列测定与分析：

将菌液PCR鉴定结果为阳性的菌液送华大基因测序，用DNAstar生物软件对测序结果进行分析；

6)pcDNA3.1-IE（-94/+52）-GFP以及pcDNA3.1-IE（-945/+52）-GFP表达载体的构建：

用限制性内切酶SacI和Mlu 1分别酶切pcDNA3.1-GFP、PEASY-T1-IE（-94/+52）、PEASY-T1-IE（-945/+52），胶回收目的片段pcDNA3.1-GFP、IE（-94/+52）、IE（-945/+52）。将IE（-94/+52）、IE（-945/+52）分别与pcDNA3.1–GFP进行连接，连接方法：pcDNA3.1–GFP 2μL，IE（-94/+52）（或IE（-945/+52））10μL，T4DNA Ligase 1μL，5×T4DNA Ligase Buffer 4μL，加水补足20μL，室温连接10min，连接产物的转化以及重组子的鉴定方法同上。