[发明专利]两个对虾新型表达载体构建方法无效

专利信息
申请号: 201210536951.1 申请日: 2012-12-12
公开(公告)号: CN102978239A 公开(公告)日: 2013-03-20
发明(设计)人: 黎铭;陈晓汉;马春霞;谢达祥;赵永贞 申请(专利权)人: 广西壮族自治区水产研究所
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;C12N15/66
代理公司: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 王素娥
地址: 530021 广*** 国省代码: 广西;45
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摘要:
搜索关键词: 两个 对虾 新型 表达 载体 构建 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及对虾细胞分子生物学研究以及对虾抗病药物开发领域,具体是两个对虾新型表达载体构建方法。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)在我国海水养殖业中占有极为重要的地位。然而,由于对虾病毒的广泛传播,每年给对虾养殖业造成数百亿元的经济损失,严重影响对虾养殖业可持续发展。虽然目前在对虾病原诊断技术方面已取得了较大进展,但是在病毒防治方面仍然没有很好的解决办法。对虾抗病毒药物尚处在研究阶段,主要研究方向有亚单位疫苗、核酸疫苗、卵黄抗体、中草药等,其中,在亚单位疫苗方研究报道较多,VP28蛋白已在家蚕蛹、昆虫细胞、毕赤酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等不同宿主表达系统内表达,通过腹肌注射或口服途径,发现表达产物对日本对虾、斑节对虾、克氏原螯虾等具有提高免疫力和抗WSSV感染的作用。孟小林等将WSSV衣壳蛋白基因克隆到表达载体pcDNA3.1,获得重组表达载体pcDNA-VP28,该表达载体转化沙门氏菌(Salmonella typhimurium)后经口服途径进入对虾体内,并使对虾产生了对WSSV的抗病力。攻毒实验表明,口服基因工程菌后第7﹑15﹑25天的保护率分别达到83.3%﹑66.7%﹑56.7%,基因工程菌经口服进入对虾肠道后可存活7-10天,同时宿主对虾没有任何明显的毒害作用。

启动子是基因(gene)的一个组成部分,控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”,决定基因的活动。启动子本身并不控制基因活动,而是通过与称为转录(transcription)因子的这种蛋白质(proteins)结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”,指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases)的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。

对虾病毒WSSV有三个早期启动子(IE1、IE2、IE3),其中IE1的启动能力最强,它在整个病毒感染周期均起作用。有研究证明,IE1启动子在昆虫细胞Sf9具有很强的活性,后者被用于WSSV基因在各细胞期的表达研究,尽管Sf9是WSSV非易感性细胞。IE1有一个Cys2/His2型锌指结构,是启动子活性的特征性部件。Fang He等用IE启动子构建表达流感病毒HA基因的重组杆状病毒载体,宿主细胞为Sf9。研究发现:相对于CMV启动子,IE启动子控制下的重组杆状病毒在细胞中的表达能力得到增强。王煜等为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性,利用IE1启动子及其截短的m IE1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子PPH构建了含有不同启动子控制下的EGF P报告基因的重组杆状病毒,分别感染S f9昆虫细胞,利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明,WSSV的IE1启动子和杆状病毒的m E T L启动子在昆虫细胞S f 9细胞中都具有较强而早的启动子活性,能够控制报告基因早期高效表达,而PPH在感染后期才表现较强活性。

pcDNA3.1-GFP是一个真核表达载体,其启动子为CMV启动子。该载体可以在多种哺乳动物(人、猪、小鼠等)细胞以及非哺乳动物(鱼、昆虫等)细胞表达,因此被广泛用于各种动物的细胞生物学研究甚至疫苗的研发。目前尚没有关于利用IE1启动子对pcDNA3.1进行改造的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种两个对虾新型表达载体构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下:

两个对虾新型表达载体构建方法,操作步骤如下:

两个对虾新型表达载体构建方法,其特征是两个对虾新型表达载体是双链环状DNA,是通过改造真核表达载体PCDNA3.1获得的,方法如下:

1.引物设计与合成:

参照GenBanK中WSSV基因组序列合成WSSV病毒早期基因启动子IE(-94/+52)和IE(-945/+52)引物,见表1:

表1引物

Tab.1Primer

引物由华大基因生物工程有限公司合成;

2.IE(-94/+52)和IE(-945/+52)的扩增:

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