[发明专利]一种细菌通用PCR检测方法

权利要求书

1.一种细菌通用的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）样品处理：

无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40℃下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；

2）核酸提取：

将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；

3）PCR扩增：

设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增；

4）PCR产物克隆、测序：

PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物16℃过夜连接PMD-18T克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，用上述引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。

2.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤1）中恒温培养箱的温度为35-40℃，培养时间为18-24h。

3.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤1）中消化处理过程为1ml的细菌中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃、5min终止消化。

4.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中所述PCR反应体系为细菌DNA模板1-10μl、10×PCR buffer5-20μl、dNTPs Mixture4-10μl、r Taq0.25μl、ddH2O补足50μl；引物的加入量为16SrDNA F1-μl、16SrDNA R1μl。

5.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中PCR扩增程序为96℃，预变性2min；96℃，30s； 55℃，30s；72℃，60s；35个循环，72℃，10min，4℃保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

6.根据权利要求1所述的细菌通用的PCR检测方法，其特征在于：步骤4）中克隆程序为将连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h；将培养液3000rpm离心3min，弃去400μl培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h。