[发明专利]一种细菌通用PCR检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及细菌检测领域，具体涉及一种细菌通用的PCR检测方法，用于所有细菌的检测。

 

背景技术

疫苗等生物制品的生产需要遵从药品产生质量管理规范，并且在规范的质量检测体系经过严格的检测才能确保疫苗安全性和有效性，以求最大效率地提高接种后的效应作用，最大限度地降低免疫接种后的不良反应。微生物检验是医疗器械、生物药品等生产制造行业产品质量控制的重要内容，其内容主要包括以培养方法检测是否有细菌、支原体等微生物的污染；其中菌检是微生物检测的最基本也是最重要的组成部分，纯菌实验检测诸如减毒活菌苗自身菌体的活菌量、总菌量以及是否有其他杂菌的存在；以及以CHO细胞毒试验、HeLa细胞毒等试验检测细菌毒素的活力等。传统方法对检测场所和检测人员素质要求较高，且培养基的配制、质控标准的把握等繁琐，且需时较长，不利于快速做出判断。

原核生物的r RNA含有3种类型：23S、16S、5SrRNA，它们分别含有2,900、1540和120个核苷酸。16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，其编码基因是16SrDNA；16SrDNA长度适中信息量较大、易分析，且在有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出具有细菌高度特异性的片段，是生物的种属鉴定和系统的重要分子基础。以16SrDNA为目的现代分子生物学技术能精确的揭示微生物种类和遗传的多样性，从而16SrDNA序列分析成了微生物分类鉴定主要依据。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到了广泛的应用。

发明内容

鉴于传统检测方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种细菌通用的PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性，克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种细菌通用的PCR检测方法，包括以下步骤：

1）样品处理：

无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35-40℃下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；

2）核酸提取：

将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；

3）PCR扩增：

设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增；

4）PCR产物克隆、测序：

PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物16℃过夜连接PMD-18T克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，用上述引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。

步骤1）中恒温培养箱的温度为35-40℃，培养时间为18-24h。

步骤1）中消化处理过程为1ml的细菌中分别加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃、5min终止消化。

步骤3）中所述PCR反应体系为细菌DNA模板1-10μl、10×PCR buffer5-20μl、dNTPs Mixture4-10μl、r Taq0.25μl、ddH2O补足50μl；引物的加入量为16SrDNA F1-μl、16SrDNA R1μl。

步骤3）中所述PCR扩增程序为96℃，预变性2min；96℃，30s； 55℃，30s；72℃，60s；35个循环，72℃，10min，4℃保存；扩增产物用1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。

步骤4）中克隆程序为将连接产物加入至100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于42℃水浴热激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h；将培养液3000rpm离心3min，弃去400μl培养基，剩余培养基重新与离心细菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h。